黄渤海来源放线菌集成筛选及次级代谢产物研究

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1、谨以此论文献给万方数据黄渤海来源放线菌集成筛选及次级代谢产物研究学位论文答辩日期：指导教师签字：答辩委员会成员签字：万方数据独创声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含未获得（注：如没有其他需要特别声明的，本栏可空）或其他教育机构的学位或证书使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：签字日期：年月日----------------------------------------

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3、天然活性物质重要来源的微生物资源——放线菌，其开发和利用一直备受关注。生存于海洋这个特殊生态环境中的放线菌，必定具备了不同于陆地放线菌的独特代谢途径，这就为结构新颖、生物活性良好的药物先导化合物的发现提供了重要资源。基于本实验室化学-基因-活性集成筛选模型，本论文对黄渤海海泥样品中的放线菌进行了分离和集成筛选，并对两株目标菌株进行次级代谢产物的研究。主要内容包括：海洋来源放线菌的分离与纯化；菌株的化学-基因-活性集成筛选；目标菌株发酵条件的考察及发酵；单体化合物分离纯化、结构确定及生物活性评价；潜力菌株的OSMAC策略研究。本研究从黄海和渤海两个来源的17个海泥样品中分离到142

4、株放线菌，并结合实验室原有的海洋放线菌资源库中的221株放线菌一起进行菌株筛选。经化学筛选后共获得107株次级代谢产物丰富的潜力菌株，通过对HPLC指纹图谱分析，设计基于PKSI功能基因的特异性引物对其中13株菌进行基因筛选，获得3株基因筛选呈阳性的菌株，选取其中一株HPLC图谱特征的放线菌LXF-80为本文的重点实验菌株。同时，对化学筛选后的107株菌采用小鼠白血病细胞P388，经SRB法活性测试获得46株具有良好抗肿瘤活性的菌株，从中选取一株HPLC图谱呈系列吸收且PKSI基因筛选呈阳性的放线菌LXF-75作为另一株重点菌株。由于菌株LXF-80产生的代谢产物较为特别，本研究

5、采取OSMAC策略通过添加生物合成途径抑制剂对其进行了进一步的研究。综合利用硅胶柱层析、凝胶柱层析和半制备HPLC等方法对发酵产物的乙酸乙酯萃取物进行分离提取，从菌株LXF-80的发酵浸膏中分离到了12个化合物，包括1个新天然产物YT87(b)(1)，1个enterocin类化合物(2)，1个萜类化合物(3)，5个环二肽类化合物(4-8)，4个苯的衍生物(9-12)；从菌株LXF-80添加抑制剂培养的乙酸乙酯萃取物浸膏中分离到2个化合物5-deoxyenterocin(13)，3-epi-5-deoxyenterocin(14)；从菌株LXF-75中分离到了12个化合物，5个二酮

6、哌嗪类化合物(15-19)，其中化合物15为新化合物，其他类化合物1个(20)，苯的衍生物6个(21-26)。万方数据黄渤海来源放线菌集成筛选及次级代谢产物研究采用MTT和SRB法，以P388、Hela、A-549、HL-60、K562等5种细胞药理模型对分离到的单体化合物1-2、15-20进行了初步体外抗肿瘤活性评价，结果显示，在50μM的终浓度下，化合物15对Hela细胞的抑制率为90.58%，化合物16对Hela细胞的抑制率为89.84%，评测两个化合物对Hela细胞抑制活性的IC50分别为：化合物15为30.1μM，化合物16为15.6μM。综上所述，本研究从两株黄渤海海

7、泥来源的放线菌中分离并解析了26个化合物的结构，包括1个新化合物和1个新天然产物，通过活性评价，发现了化合物15和16有一定抗Hela细胞活性，为海洋放线菌的天然产物的研究提供了丰富的资源。此外，随着分子生物学的发展，通过基因筛选结合化学筛选，定向的追踪目标化合物，极大提高了寻找新颖天然产物的效率，结合生物合成途径的研究，采取OSMAC策略，对优质菌株进行深入挖掘，不仅能有效克服单纯以生物活性和化学筛选为导向的天然产物分离中高活性旧化合物或低活性新化合物出现几率高的问题，同时也为