糖皮质激素反常促进人羊膜成纤维细胞中前列腺素合成关键酶-2基因表达的分子机制

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1、复旦大学硕士学位论文糖皮质激素反常促进人羊膜成纤维细胞中前列腺素合成关键酶-2基因表达的分子机制姓名：朱小鸥申请学位级别：硕士专业：生物物理学指导教师：孙刚200905复口．大学硕七学位论文糖皮质激素反常促进人羊膜成纤维细胞中前列腺素合成关键酶环氧合酶一2基因表达的分子机制中文摘要流行病学调查发现，早产儿成年后可能易患心血管疾病、糖尿病和肥胖等。因此，防治早产是优生优育的重要一环，但目前尚缺乏防治和预测早产的有效手段，其主要原因是人类分娩启动的机制尚未解析。因此，解析人类分娩启动机制、优生优育已经成为国际生殖生物学领域的研究热点之一。糖皮质激素是经典的抗炎激素，可以诱导抗

2、炎因子的合成并抑制炎症介质如前列腺素(PG)的合成，但大量实验表明，糖皮质激素对人羊膜前列腺素的合成具有反常的促进作用，由于PG在分娩时可促进子宫平滑肌收缩即能诱发宫缩、促进宫颈成熟及促进胎膜破裂，所以其在分娩发动中起主导作用。因此糖皮质激素反常促进人羊膜PG合成的作用可能是分娩发动的重要机制之一。现已明确，糖皮质激素的反常促进羊膜前列腺素合成的作用是通过诱导羊膜成纤维细胞胞浆型磷脂酶A2(cPLA2)和-fiij'歹,J腺素H合酶一2(PGHS一2)即环氧合酶一2(CoX一2)表达来实现的，但其分子机制尚未阐明。本课题克隆了人羊膜成纤维细胞COX-2基因的启动子，在此基

3、础上研究了糖皮质激素反常促进人羊膜成纤维细胞COX-2基因表达的分子机制，以初步解析糖皮质激素反常促进人羊膜成纤维细胞PG合成的分子机制。研究内容：首先通过实时定量PCR从COX-2mRNA水平验证糖皮质激素(Gc)对人羊膜成纤维细胞COX-2表达的反常促进作用，同时研究糖皮质激素对COX一2表达反常促进作用的特点，即是否受糖皮质激素受体介导、其作用是否通过刺激转录过程实现的。其次，如果糖皮质激素对人羊膜成纤维细胞COX-2表达确有反常促进作用，而且此作用依赖于转录过程，我tfJ贝,J对人羊膜成纤维细胞COX一2基因启动子进行克隆及构建报告基因重组质粒并做进一步的细胞转染

4、实验，以确定糖皮质激素是否对COX-2基因启动子具有直接作用以及糖皮质激素对COX一2基因启动子反常促进作用的特点；如果糖皮质激素确实对COX一2基因启动子具有直接作用，那么我们需要进一步确定COX一2基因启动子上介导糖皮质激素作用的顺式作用元件。为了验证糖皮质激素对人羊膜成纤维细胞COX-2表达的反常促进作用的特异性，我们同时也在人胎儿肺成纤维细胞株(HFL-1)中做了比较对照实验，以确认糖皮质激素反常促进人羊膜成纤维细胞COX_2表达的可靠性。复．口．火学硕十学位论文主要研究方法：l、取样、收集、培养人足月择期剖宫产羊膜成纤维细胞，抽提人羊膜成纤维细胞mRNA、逆转录

5、并做荧光实时定量PCR检测糖皮质激素(皮质醇)对COX-2mRNA水平的影响，并与HFL一1细胞进行比较。2、克隆人羊膜成纤维细胞COX-2基因启动子，构建COX-2基因启动子荧光素酶报告基因重组质粒，并转染人羊膜成纤维细胞和HFL-1细胞，研究在这两种细胞中糖皮质激素(皮质醇)对COX-2基因启动子活性影响的异同。3、构建不同5’未端长度的COX-2启动子报告基因质粒并转染人羊膜成纤维细胞细胞及HFL-I细胞以找出糖皮质激素(皮质醇)对COX-2基因启动子的大致调节位点，在此基础上对可能位点进行定点突变，以确认介导皮质醇作用的顺式反应元件。4．在上述实验的基础上，用染色

6、质免疫沉淀(CHIP)的方法，研究所推断的转录因子是否可以与所识别的介导皮质醇作用的顺式反应元件相结合。主要研究结果：1．皮质醇对人羊膜成纤维细胞COX-2mRNA表达确有反常促进作用，而在人胎儿肺细胞株中糖皮质激素对COX-2mRNA的表达则是经典的抑制作用，而且皮质醇对人羊膜成纤维细胞COX-2表达的反常促进作用可以被糖皮质激素受体拮抗剂RU486和mRNA转录抑制剂DRB所阻断，说明此反常促进是由GR受体介导的转录促进过程。2．从培养的人羊膜成纤维细胞中成功克隆了COX一2基因启动子一886bp一一--+33bp片段，经测序，该序列与Genbank中所报道序列相同。

7、将克隆的CoX一2基因启动子与含报告基因的质粒进行重组和扩增，并用其转染人羊膜成纤维细胞和HFL-1细胞，发现皮质醇在人羊膜成纤维细胞细胞中对COX-2基因启动子活性具有剂量依赖性促进作用，而且可以被RU486所阻断，而在HFL细胞中皮质醇对COX-2启动子活性则是经典的剂量依赖性抑制作用，而且也可以被RU486所阻断，另外，皮质醇还可以阻断白细胞介素一lB对COX一2基因启动子的诱导作用。3．我们进一步采用了由5’末端向3’末端逐渐删除COX-2基因启动子的方法，研究了介导皮质醇对人羊膜成纤维细胞和HFL一1细胞COX-2基