虎纹蛙病毒毒力相关orf10、凋亡相关orf80的研究

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1、中山大学硕士学位论文虎纹蛙病毒毒力相关ORFIO、凋亡相关ORF80的研究专业：水生生物学姓名：周杰指导教师：何建国教授吕玲副教授答辩委员会：主席委员：荔7蔷学位授予单位：中山大学，广州二零零七年六月周杰中山大学硕士学位论文虎纹蛙病毒毒力相关ORFl0、凋亡相关ORF80的研究专业：水生生物学姓名：周杰指导教师：何建国教授吕玲副教授中文摘要虎纹蛙病毒0igerfrogvirus,1TV)是虹彩病毒的一种，也是养殖虎纹蛙蝌蚪和中华鳖发病致死的主要病原之一，本实验在已完成虎纹蛙病毒的全基因组测序的基础上，对其ORFl0和ORFS0蛋白进行相互作用蛋白相关、凋亡相关以及毒力相关方面进行

2、了研究．本试验先从虎纹蛙病毒各基因的生物信息学分析以及实验室已有基础入手，筛选出虎纹蛙病毒的o,／70与orf80基因作为研究对象．据核苷酸和蛋白质序列比对分析，ORFl0没有任何同源的相似序列和保守结构域，而且根据本实验室初步的基因芯片分析与半定量RT-PCR结果发现其基因在11Ⅳ感染宿主后有大量表达；而o】＆F80蛋白则含有一个与脂多糖诱导的肿瘤坏死因子t因子(u塔inducedTNF-afactor,LITAF)膜结合基序非常相似的结构域，即N端的CXXC结构域，中间由几十个氨基酸所组成的长的疏水区再加上C端的(H)XCXXC结构域。为进行蛋白相互作用方面的研究，将o,／7

3、0和orfS0基因克隆至原核表达载体并诱导表达和纯化，成功制备了抗ORFS0蛋白的小鼠抗体，通过蛋白沉降、免疫沉淀和Far-WesternBlot等方法检测了与1F、，ORF80蛋白相互作用的蛋白。为了研究这两个基因对细胞凋亡的影响，将两基因克隆至真核表达载体并转染至FHM(fatheadmimlow)细胞，通过凋亡染色与细胞计数。结果显示ORFS0蛋白的周杰中山大学硕士学位论文单独表达会导致比较明显的宿主细胞凋亡，而ORFlO则不会引起细胞凋亡，这说明ORFS0与细胞凋亡的诱导产生相关。为了鉴定两基因的表达对骶Ⅳ毒力的影响，在FHM细胞中进行RNA干扰实验，转染针对两基因的特异

4、的siRNA后进行11w感染，发现ORFl0被抑制后能够明显抑制11Ⅳ引发的细胞病理变化，而ORF80被抑制则没有这种效果，说明o,7'10基因是TFv毒力相关的重要基因。本文通过相互作用蛋白筛选、细胞凋亡诱导的鉴定以及毒力相关RNA干扰抑制的鉴定三个方面对nⅣORFl0和ORF80的功能进行了初步研究，为1rIⅣ侵染过程中引起的细胞凋亡机理的研究以及TFv重要毒力基因的筛选打下基础。关键词：虎纹蛙病毒，相互作用蛋白，细胞凋亡，RNA干扰，脂多糖诱导的肿瘤坏死因子a因子(UTAV)H罔杰中山大学硕士学位论文StudyonORFIOoftigerfrogvirus(TFV)rela

5、tedtovirulenceandORF80relatedtoapoptosisMajor：HydrobiologyName：ZhouJi吧Supervisor：Prof．HeJianguoAssociateProf．LvLingTigerflogvirus(tigerfrogvkus,硎瓷onekindofiridovlrusesandisidentifiedasmainpathogenwhichcauscsRana疽gr／naru舶／osatadpo／eandTr／nyx面堋协妇’sdeath．TheidentificationofgcnomesequenceofTF、，wa

6、salreadycompletedandORFl0andORFS0WeI'eselectedtod0somebasicresearchcsaboutinteractionalproteins,apopotosisandvirulenceinthispaperBasedonbininformaticsanalysisandsomepreviousworksofourlab,TFyorfWand删geneswmselectedinourstudy．NucleotideandproteinscqnelK七analysisshowedthatORFIOhad∞8JmLlafsequenc

7、eandconserveddomaincomparedwithdatabase,andOUrlab’8wevio憾genechipandRT-PCRrcsul／sshowedthatithas-highexpressionlevelinhostaftervkusinfection．ThecomerveddomainanalysisofthesequenceofORF80’samino∞缸showedthatitbadadomainthatWagvery$imilartO_memb