甲苯噻嗪对超级化激活的环腺苷酸门控阳离子通道影响的实验研究

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1、遵义医学院硕士学位论文甲苯噻嗪对超级化激活的环腺苷酸门控阳离子通道影响的实验研究姓名：朱亮先申请学位级别：硕士专业：麻醉学指导教师：芶大明20120411遵义医学院硕士学位论文甲苯噻嗪对超极化激活的环腺苷酸离子通道的实验研究甲苯噻嗪对超极化激活的环腺苷酸门控阳离子通道影响的实验研究中文摘要目的：建立膜片嵌实验中适于记录超极化激活环核苷酸门控(hyperpolarization-activatedcyclicnucleotide-gated，HCN)阳离子通道产生的超极化激活电流(hyperpolarization．activatedcurrents，厶)【1】的方法，重

2、组HCNl基因PCE．HCNl质粒DNA，重组HCN2基因PCE．HCN2质粒DNA经瞬时转染经培养的HEK293细胞，HEK293细胞表达HCN离子通道，研究甲苯噻嗪对HCNl离子通道，HCN2离子通道的影响。方法：重组HCNl质粒DNA或重组的HCN2质粒DNA经脂质体瞬时转染哺乳动物细胞构建稳定表达HCNl或HCN2离子通道的细胞模型，选取细胞表面光滑，贴壁良好，圆形的细胞进行电生理实验。首先按预先设定的刺激方案来干预细胞，诱导出厶电流，然后分别给予12．5um／L甲苯噻嗪，25um／L甲苯噻嗪，50urn／L甲苯噻嗪，100um／L甲苯噻嗪，记录甲苯噻嗪对HCN

3、l和HCN2离子通道动力学的影响，得到I．V曲线，通道的激活曲线，统计甲苯噻嗪对HCNl离子通道和HCN2离子通道电流抑制幅度；并计算出甲苯噻嗪对HCNlvl，2和HCN2vl／2(Vl／2是离子通道激活50％时的膜电位)电压的偏移；计算出不同溶度的甲苯噻嗪在生理电压下(-90mv)对HCNl和HCN2通道电流的抑制率，同时对比相同浓度下甲苯噻嗪对HCN离子通道不同亚型HCNl与HCN2离子通道的敏感性。结果：经瞬时转染HEK293细胞能产生稳定表达HCNl或HCN2离子通道的细胞模型，细胞质量好，形态结构规则，有60个细胞成功的记录到厶电流并最终完成全部实验。甲苯噻嗪

4、在不同的浓度下减小了HCNl的电流，使得HCNl的I．V曲线上移，甲苯噻嗪在12．5um／1到100um／L的临床浓度范围内，使得HCNlvl／2从．83．31-+2．74my向．99．83-+5．08my偏移(n_6，p<0．05)，我们发现在正常生理条件电压下(-90mv)，甲苯噻遵义医学院硕士学位论文甲苯噻嗪对超极化激活的环腺苷酸离子通道的实验研究嗪在12．5um／1到100um／L的临床浓度范围内抑制了HCNl电流幅度分别为90／社0．06到42％士0．16(n=6，p<0．05)。有趣的是，甲苯噻嗪不但抑制了HCNl通道而且对HCN2离子通道也很敏感，使得HC

5、N2的I．V曲线上移，使得HCN2vl／2从．98．55-4-3．93mv向-110．65+3．78my偏移(n一6，p<0．05)，同时甲苯噻嗪在正常生理条件电压下(．90mv)12．5um／t到100um／L的临床浓度范围内也抑制了HCN2电流幅度分别为270／硅0．05到700／社0．11(n=6，p<0．05)。甲苯噻嗪在正常生理条件电压下(-90mv)与相同的浓度范围内分别作用HCN离子通道不同亚基HCNl与HCN2离子通道，发现甲苯噻嗪对HCN2离子通道的作用更敏感。结论：瞬时转染的HEK293细胞能构建稳定表达的HCN离子通道，转染后的细胞存活率高，细胞膜

6、完整，细胞表面光滑，能够用于记录HCNl离子通道与HCN2离子通道产生的m电流。甲苯噻嗪能显著的抑制HCNl离子通道和HCN2离子通道，提示其可能是甲苯噻嗪的麻醉作用机制之一。随着甲苯噻嗪的浓度增加，其对HCN离子通道产生的m电流抑制逐渐增大，因此甲苯噻嗪对HCN离子通道的抑制作用呈现剂量依赖性。关键词：HCN甲苯噻嗪膜片嵌厶电流遵义医学院硕士学位论文甲苯噻嗪对超极化激活的环腺苷酸离子通道的实验研究ImpairmentofHyperpolarization—Activated，CycficNucleotide—GatedChannelFunctionbytheIntra

7、venousGeneralAnestheticxylazineAbstractobjective：Suitableintheestablishmentofthepatchclampexperimenttorecordhyperpolarization—activatedcyclicnucleotidegatedcationchannelsinthehyperpolarization—activatedcurrent，recombinantHCN1genepce-HCN1plasmidDNA，recombinantHCN2genethePC