丛枝菌根真菌对丹参根部病害抗病性及其机理的研究

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1、西南交通大学硕士研究生学位论文第f页摘要丹参(SalviamiltiorrhizaBge)，俗称活血根，是世界公认的治疗心脑血管病的首选药物，年需求量15000吨左右，是栽培面积较大的药材之一。但是，随着丹参栽培年限延长，根部病害的发生率逐年提高，栽培2～4年丹参根部病害的发生率达到了60％．70％，严重影响丹参的产量和质量，而丹参根部病害的化学防治效果甚微。目前采用生物防治方法是解决中药材根部病害的最佳选择。丛枝菌根真菌(ArbuscularMycorrhizalFungi，AMF)在抗植物土传病害方面具有很大的潜力，但是AMF对于不同的

2、病原菌，其抗病性不同。国内外关于AM-F对植物病害的抗病机理也没有统一定论。本论文主要针对丹参栽培过程中的上述问题，采用AMF作为生防菌，研究AMF对丹参根部病害的抗病规律及其机理。其旨在有效缓解栽培丹参根部病害的发生，为提高丹参的产量和质量提供指导，同时为中药材根部病害的研究提供一种新的思路和方法。实验方法1、丹参根部病害病原菌的分离、纯化与鉴定。(1)采集丹参病株，取病健交界部位采用PDA培养基分离纯化病原菌，记录菌落形态特征，在光学显微镜下观察培养病原菌的分生孢子和分生孢子梗形态，并测量其大小。根据病原菌的菌落形态及产孢结构，对其进行

3、传统形态学鉴定。(2)采用CTAB法提取病原菌DNA，选取真菌通用引用ITS扩增目的核酸片段，测序，在NCBI的GENBANK库中进行序列比对，判断所获菌株的种类或其近缘的物种。2、在温室盆栽条件下，采用蘸根接种病原菌的方法，研究病原菌对丹参幼苗的致病性及生理生化方面的影响。(1)采用计数法计算植物发病率，并统计接菌后7d对地上和地下部分鲜重的影响。(2)分别检测病原菌处理后ld、3d、5d、7d、lld对丹参幼苗根内多酚氧化酶(PPO)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)、过氧化物酶(POD)和超氧化物歧化酶(SOD)四种与植物诱导抗病性相关的防御

4、酶活性的变化情况。(3)选择SA途径和JA途径上的病程相关蛋白和防御基因序列，设计引物，采用RT．qPCR的方法子病原菌蘸根处理后3d、5d、7d，对丹参幼苗根中的病程相关基因表达变化进行分析。(4)采用SPSSl6．0统计软件对实验结果进行统计分析。3、在温室盆栽条件下，研究不同种类丛枝菌根真菌(ArbuscularMycorrhizaiFungi，西南交通大学硕士研究生学位论文第1l页AMF)[摩西球囊霉(Glomusmosseae，GM)、地表球囊霉(Glomusversiforing，GV)、根内球囊霉(Glomusintrarad

5、ices，GI)]对丹参生长及有效成分的影响。(1)根据Bierman和Linderman(1981)建立的方法测定不同AMF处理后365天的菌根侵染率以评估不同AMF与丹参的共生情况。(2)考察不同AMF处理后365天对丹参株高，地上地下部分分枝数，地上地下部分干重等生物量积累的影响。(3)采用国际上通用的Li．6400便携式光合作用系统考察不同AMF处理后丹参幼苗叶片净光合速率(Pn)、蒸腾速率(丹)、气孔导度(Gs)和胞间C02浓度(a)等气体交换参数的动态变化，并同时测定了叶片中叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素和可溶性糖含量，从光合作

6、用的角度阐释AMF影响丹参生物量积累的机理。(4)采用ICP．AES法检测接种AMF对丹参地上部分、地下部分大量元素钾K，微量元素铜Cu、锌Zn、镁Mg、铁Fe、锰Mn、钙Ca含量的变化情况。(5)采用HPLC法检测接种AMF对丹参植株水溶性成分迷迭香酸和丹酚酸B以及脂溶性成分丹参酮I、丹参酮IIA、二氢丹参酮、丹参新酮积累的影响。(6)采用SPSSl6．0统计软件对实验结果进行统计分析。4、在温室盆栽条件下，采用蘸根接种病原菌的方法，研究AMF对丹参根部病害的防治效果及其抗病机理。(1-)采用计数法计算植物发病率，根据病害分级标准，计算病

7、情指数，并统计接菌后20d对地上和地下部分鲜重，株高、根长的影响。(2)采用WinRHIZO根系分析系统观测接菌后20d不同处理组根长(Length)，根面积(SurfArea)，根投影面积(ProjArea)，根体积(Volume)和根尖数(Tips)，以及根的发病部位(Disease)与健康部位(Healthy)的颜色对比分析，阐释AMF对丹参根部病害的防治效果。(3)采用MIN．PAM调制式荧光分析仪测定接菌后14d不同处理组丹参植物叶片最大光化学量子PSII产量Fv／Fm、最大光化学量子PSII效率Yield、光化学碎灭系数qP、非

8、光化学碎灭系数qN等叶绿素荧光参数，并同检测叶片叶绿素含量，可溶性糖含量，从光合作用的角度阐释AMF和／或病原菌处理影响丹参生物量积累的机理。(4)采用考马斯亮蓝染色法测定接菌后