轨道交通自动门远程监控系统中的智能故障诊断技术研究

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1、编码旋毛虫31kDa抗原DNA疫苗构建及其诱导的免疫应答研究生张红卫导师崔晶王中金郑州大学基础医学院寄生虫学教研室，河南省分子医学重点学科开放实验室郑州450052摘要旋毛虫(Trichinellaspiralis)是分布最广泛的寄生虫之一，可感染人及150多种其它哺乳动物，引起的旋毛虫病(Triehinellosis)是一种严重的人兽共患病。旋毛虫病呈世界性分布，被认为是出现或再次出现的疾病。目前此病在全世界约有1100万人体感染者．国际旋毛虫病委员会(ICT)仅在1995．1997年即报道了1万多例

2、病人，国际兽医局(OIE)报道在1998年有10000多头生猪感染。在前苏联及东欧国家。由于社会制度的变化、经济或战争的原因导致国营养猪场的解散和政府兽医部门控制措施不力，结果引起家猪旋毛虫感染率的明显升高，如在俄罗斯的某些村庄猪旋毛虫的感染率达50％。在罗马尼亚猪的旋毛虫感染率为O．01％～1．4％，平均为0．158％。近年来在全国17个省、直辖市、自治区己发现人体旋毛虫病病例并已发生多起本病暴发流行。河南省为我国旋毛虫病的高发区之一，仅郑州市已发生7次暴发，400人发病。本病若不及时诊断和治疗，患者

3、的死亡率可高达3％～30％。我国人体旋毛虫病的增加与猪旋毛虫感染率的增加密切相关，如1990—1991年对河南省17个地区的100万头生猪进行旋毛虫病的流行病学调查表明，在16个地区发现了猪旋毛虫病，感染率为3．1％．15％，而1982年和1984年猪的旋毛虫感染率仅分别为O．44％和0．86％。因此．目前在我国急需开展旋毛虫痫的预防和控制工作，而采取各种措施降低动物旋毛虫的感染率特别是猪的感染率是预防和控制旋毛虫病的关键措施之一。各种旋毛虫病疫苗的开发和使用是非常重要的，对猪接种后可达到有效的的减虫率

4、和保护率，从而减少养猪业经济损失，消灭人体旋毛虫病的传染源，继而可控制人体旋毛虫病的流行。国内外学者对旋毛虫病的免疫预防进行了大量的研究工作，作为第一代疫苗，死疫苗和减毒活疫苗对感染旋毛虫的动物具有部分保护作用，但所用的抗原多为旋毛虫粗抗原，如虫体抗原、可溶性抗原及组分抗原等。因抗原组分非常复杂．往往难以取得理想的免疫预防效果且极不稳定，此外，由于旋毛虫的体外连续培养未取得成功，不能获取足够的抗原用于大规模防治旋毛虫病。随着分子生物学技术的迅速发展，利用基因工程技术在体外大量表达旋毛虫抗原已成为可能，利

5、用基因工程技术生产的重组亚单位疫苗解决了天然虫体抗原来源的困难，但基因工程重组蛋白多为融合蛋白、存在有后续分离困难和不具有天然蛋白的分子构象的缺点。1992年首先报道的DNA疫苗可诱导产生针对多种病毒、细菌和寄生虫抗原的免疫应答，还可以对肿瘤产生有效的治疗。DNA疫苗诱导产生广泛的免疫反应，包括抗体、T辅助细胞和CTL细胞免疫反应。实验研究证实对利什曼原虫、弓形虫、血吸虫、疟疾、锥虫等寄生虫感染有较好的保护作用，为旋毛虫病疫苗的研究带来了新的希望。近几年一些研究者研究了旋毛虫的抗原分子。Arasu等克隆

6、了旋毛虫的一个cDNA基因(TspEl)，编码旋毛虫3lkDa的肌幼虫蛋白，该蛋白可抵抗旋毛虫肌幼虫经胃肠道的攻击感染。我们曾利用基因工程技术将编码旋毛虫31kDa抗原的基因克隆到原核表达载体pGEMEX．1中，并在大肠杆菌中表达出了融合蛋白，Westernblot证实表达的重组蛋白具有较好的反应原性，对于旋毛虫病的免疫预防具有潜在的应用价值。因此，本研究应用基因工程技术构建编码旋毛虫31kDa抗原基因的重组真核表达质粒，接种动物后观察在体内的表达情况。旋毛虫DNA疫苗的研究将为旋毛虫病的免疫预防开创一

7、种新方法，对控制旋毛虫病的流荦亍具有重要意义。材料和方法本实验用冒蛋白酶消化法收集旋毛虫肌幼虫，通过RT-PCR方法从旋毛虫肌幼虫中获得编码旋毛虫肌幼虫3lkDa蛋白的目的基因片段，克隆到pucl8载体，通过核酸内切酶BamHI和HindIII双酶切、EcoRI单酶切和用特异性引物进行PCR鉴定阳性克隆插入目的基因片段大小的正确性。然后将目的基因亚克隆到真核表达载体pcDNA3的BamHI和HindIIl位点中，构建重组质粒Ts3I／pcDNA3。经核酸序列测定证实插入片段的正确性。登陆国际NCBIGe

8、nBank数据库进行核酸序列同源性和编码蛋白质相似性比较。将编码旋毛虫肌幼虫31kDa蛋白的DNA疫苗用基因枪注射昆明小鼠，将其注射部位的皮肤组织用感染旋毛虫小鼠的阳性血清经免疫组化检测重组蛋自的表达；用基因枪和肌肉注射的方法将编码旋毛虫肌幼虫31kDa抗原的DNA疫苗免疫BALB&小鼠，同时将pcDNA3质粒肌肉注射BALB／e小鼠作为对照；BALB／c小鼠间隔2周共免疫3次。在免疫前及末次免疫后两周采集BALB／c，j、鼠血清。应用旋毛