微生物检测菌落总数测定方法

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1、方案一微生物学检验菌落总数的测定1原理微生物活体数量的测定方法，常用平板培养计数法。它是通过将样品制成均匀的一系列不同稀释度的稀释液，再取一定的稀释液接种，使其均匀分布于培养皿中特定的培养基内，最后根据在平板上长出的菌落数计算出每克（或mL）样品中的活菌数量。2材料和仪器2.1恒温培养箱：36℃±1℃。2.2冰箱：2～5℃。2.3灭菌锅。2.4超净工作台。2.5均质器。2.6漩涡振荡器。2.7微波炉。2.8天平：感量为0.1g。2.9平皿：φ90mm。2.10锥形瓶250ml,500ml。2.1

2、1微量移液器一套（量程分别为：0～1000μl，0～100μl，0～10μl）及吸头。2.12涂棒。2.13精密pH试纸。2.14酒精灯。2.15指形瓶。2.16剪刀，镊子。2.17牛皮纸。2.18医用酒精及脱脂棉。2.19橡胶手套。2.20记号笔。3检验程序菌落总数的检验程序见下图。检样10g样品+90mL无菌生理水，均质　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　↓10倍系列稀释　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　↓选择至少3个适宜样品稀释均液方法①↙↘方法②各取1mL分别加入无菌培养皿中

3、，每皿中加入15mL~20mL平板计数琼脂培养基，混匀，凝固。在培养皿中加入15mL~20mL平板计数琼脂培养基，凝固。然后在每皿中加入0.2mL样品稀释液，涂布均匀。↘↙在36℃±1℃倒置培养24～48小时　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　↓计算各平板菌落数　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　↓计算菌落总数4操作步骤4.1培养基和试剂的配制4.1.1平板计数琼脂培养基（pl）培养基（最常用）胰蛋白胨５．０ｇ酵母浸膏２．５ｇ葡萄糖１．０ｇ琼

4、脂１５．０ｇ蒸馏水1LpH7.0～7.2将上述成分加于蒸馏水中，煮沸溶解，调节pH值，分装锥形瓶中，121℃高压灭菌15分钟。4.1.2无菌生理盐水的配制：称取8.5g氯化钠溶解于1000mL蒸馏水中，121℃高压灭菌15分钟。4.2样品的稀释：4.2.1称取25ｇ样品置盛有225ｍＬ生理盐水的无菌均质杯内，8000ｒ／min～10000ｒ／min均质１min～２min。制成10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6，10-7，10-8，10-9稀释液。4.2.2根据对样品活菌数

5、量的估计，选择3~4个适宜稀释度的样品均液（比如10-6，10-7，10-8，10-9稀释液）。4.2平板接种与培养接种方法1：用1mL微量移液器吸取不同稀释度的菌悬液1mL于一个无菌培养皿中（每个稀释度做三个重复），再在培养皿中分别倒入10～15mL已融化并冷却至45~50℃的培养基，盖好平皿盖子，趁热轻轻转动培养皿，使菌液与培养基充分混合均匀，冷凝后在恒温培养箱中倒置培养24～２８ｈ，培养温度为36℃±1℃。同时以稀释液无菌生理盐水作空白对照。注：比如1000亿CFU样品稀释梯度可选择为：1

6、0-8，10-9，10-10。接种方法2：用1mL无菌吸管或微量移液器吸取0.2ｍＬ稀释液均液于计数培养基平板上，将稀释液涂布均匀，吸附，在恒温培养箱中倒置培养24～28ｈ，培养温度为36℃±1℃。同时以无菌生理盐水作空白对照。（计算时需要把0.2mL的倍数也计算在稀释倍数内）注：比如1000亿CFU样品稀释梯度可选择为：10-7，10-8，10-9。４.3菌落计数可用肉眼观察，必要时借用放大镜或菌落计数器，以防遗漏。记录稀释倍数和相应的菌落数量。菌落计数以菌落形成单位（colony-formi

7、ngunits,CFU）表示4.3.1选取菌落数在30~300之间，无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。低于30CFU的平板记录具体菌落数，大于300的可记录为多不可计。每个稀释度的菌落数应采用3个平行平板的平均数。4.3.2其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数；若片状菌落不到平板的一半，而其余一半菌落分布又很均匀时，即可计算半个平板后乘以2，代表一个平板菌落数。4.3.3当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时，则将每条单链作为一个菌落计数

8、。4.3.4若空白对照上有菌落生长，则此次检测结果无效，需重新测定。5菌落总数的计算方法5.1若只有一个稀释度的菌落数30~100的适宜计数范围之间时，计算三个平行的平均值，再乘以相应稀释倍数，作为每克中菌落总数结果。5.2若有2个稀释度，其平均菌落数在30~100的适宜计数范围之间，应按两者菌落数之比值来决定；若其比例小于2应计数两者的平均数；若大于2则计数其中稀释度较小的菌落总数。5.3若所有稀释度的平板上菌落数均不在30~100之间时，其中一部分小于30或大于100时，则以最接近30或10