基于新型分子信标高灵敏检测癌症基因的研究

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1、万方数据温州医科大学硕士学位论文答辩委员会主席：邳垂挞塾握!j匕塞堡王太堂2答辩委员会成员：墨廷斐塾拯(j匕塞太堂2一生圭筮塾拯(逞趔医型太堂2万方数据温州医科大学硕士学位论文目录中文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1英文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯3第一部分基于荧光彻底恢复的分子信标高灵敏检测p53基因的研究⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯6前言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯6材料和方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯

2、⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯7结果和讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯8一J、结⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯18参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯OOQOral⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯19第二部分基于双发夹结构的分子信标灵敏检测KRAS基因的研究⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯21前言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯21材料和方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯21结果和讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯

3、⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯23，】、结⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯29参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯29总结⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯31附录⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯32致谢⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯33第三部分综述⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯34参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯47独创性声明⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯

4、55万方数据温州医科大学硕士学位论文基于新型分子信标高灵敏检测癌症基因的研究中文摘要目的癌症是严重危害人类健康的疾病之一，目前对于晚期癌症仍难以攻克，及早发现与治疗仍然是目前治疗癌症最有效的手段，因此癌症的早期检测对于提高癌症患者生存率具有重大意义。早期癌症患者经常伴随着某些基因表达的异常，但是一般无明显症状，难以检测。随着现代分子生物学的发展，应用分子诊断手段使得对癌症患者进行早期诊断成为可能，其中开发能定量检测基因表达的新颖方法是必要的。本研究设计了新型分子信标并开发基于它们的检测系统，用来

5、高灵敏高特异地定量检测癌症相关基因，如p53基因、KRAS基因等，为进一步开发多功能的信标设计和检测平台提供理论基础，以促进癌症早期诊断的发展。方法1．利用核酸DNA碱基之问的特异性配对杂交作用和酶催化作用，设计基于分子信标的生物传感系统，检测p53基因、KRAS基因，检测系统中用到的包括目标基因序列和荧光共价标记的序列全部由公司合成。实体样品检测，使用5％的胎牛血清模拟复杂的生物环境。2．系统检测目标是由荧光强度的大小来判断的，反应终止后，加入适量的缓冲液，使用荧光分光光度计检测，设置的参数由

6、所使用的荧光基团类型而定，FAM标记的序列，参数设置是激发光波长492nm，收集的荧光发射信号波长范围是500到600nm，综合时间O．5s，扫描速度240nm／min，激发和发射缝隙都是5nm，光电倍增管电压是600V．519nnl处的荧光峰值作为评价检测系统的信号响应能力的标准。3．在探究信号转导的分子机制时，利用12％的聚丙烯酰胺凝胶电泳验证生成的产物。电泳条件是在0．5xTBE缓冲液中恒压80V，时间90min，荧光成像的拍摄是在带有ImageLab图像采集和分析软件的化学发光仪进行。S

7、YBRGreen1只是在看DNAmarker时候使用，其余都是利用分子信标自身的荧光基团来进行观察分析。结果1．设计了一个含有3’伸出端的分子信标(3’overhang-containedMB。OMB)并能用来检测抑癌基因p53。新设计的OMB不仅能够完成循环的核酸链置换反应(cyclicalnucleicacidstrand-displacementpolymerization，万方数据温州医科大学硕士学位论文CNDP)，而且它的淬灭基团DABCYL还能够被限制性切割酶切除，从而完全恢复荧光基

8、团FAM被淬灭的荧光信号。利用这个检测系统，可以在液相中检测到的目标基因低至10pM，还可以获得从0．01到150nM的线性范围。更可喜的是这个检测平台可以很容易的区分p53基因的突变型和野生型。2．在DNA检测的过程中，双发夹结构探针(DHMB)在没有任何外源因素帮助的情况下能够执行信号传导，与传统的一个目标分子只能打开一个发夹结构并随之引起一对荧光基团和淬灭基团分离而释放荧光(即1：1)不同，这个体系中一个目标分子与一个DHMB杂交并打开发夹后，能让两个DHMB相互作用，从而引起两对荧光基团