依达拉奉对缺氧复氧酸中毒损伤神经元的保护作用及机制研究

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1、万方数据中图分类号UDCR741610博士学位论文学校代码10533依达拉奉对缺氧复氧酸中毒损伤神经元的保护作用及机制研究(Thestudyoftheprotectiveeffectsandmechanism—n一-●‘1lo0tEdaravone0nneurona!InlnryinducedbyhypOxla‘，-一一一andacidosis／reoxygenation)作者姓名：学科专业：研究方向：学院(系、所)：指导教师：昌0指导教师：王桂斌临床医学神经病学湘雅医学院刘运海教授张宁副教授中南大学2014年5月

2、万方数据学位论文原创性声明本人郑重声明，所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了论文中特另tlDn以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中南大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我共同工作的同志对本研究所作的贡献均已在论文中作了明确的说明。申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。作者签名：差丛日期：型竺年三月互日学位论文版权使用授权书本学位论文作者和指导教师完全了解中南大学有关保留、使用学位论文的规定：即学校

3、有权保留并向国家有关部门或机构送交学位论文的复印件和电子版；本人允许本学位论文被查阅和借阅；学校可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用复印、缩印或其它手段保存和汇编本学位论文。保密论文待解密后适应本声明。作者虢塑垄焱、导师签名日期：世年二月j日日期：塑坐年二月尘日万方数据博士学位论文中文摘要第一章依达拉奉减轻缺氧复氧酸中毒诱导的神经元毒性损伤的作用及分子机制研究摘要目的：1研究依达拉奉对缺氧复氧酸中毒诱导的神经元毒性损伤的作用；2探讨依达拉奉对缺氧复酸中毒损伤的神经元保护的分子作用机制。方

4、法：1建立缺氧缺糖复氧酸中毒(OGD。～R)神经元损伤模型，为消除谷氨酸盐活性及电压依赖的Caz+通道作用，所有操作中均加入了NMDA和AMPA受体阻滞剂和电压门控Ca2+通道拮抗剂；2分空白对照组、OGD．A／R组、OGD—A／R加不同浓度依达拉奉组、OGD—A／R加ASICs阻断剂组，检测不同时段LDH释放量、Caspase一3活性、Hoechst33258染色，并进行比较来评价依达拉奉对OGD—A／R损伤神经元的保护作用；3选择适当浓度的依达拉奉、ASICla阻滞剂及MEK／ERK阻滞剂分别对不同组别OGD—

5、A／R模型培养中的细胞进行预处理，用Western．blot检测ERK、AKT及Bcl一2蛋白表达，RT-PCR检测BDNF、Bcl一2mRNA表达，ELISIA检测BDNF蛋白表达，相应试剂盒或试万方数据博士学位论文中文摘要剂检测LDH释放量(检测细胞损伤)及Hoechst33258染色(观察细胞凋亡)。分析比较相应数据探讨依达拉奉在OGD．A／R模型中可能的保护机制。结果：1成功建立了OGD．A／R模型，并发现4h和8h即可出现LDH释放量爆发性增加。2ASICs阻滞剂PcTX和amiloride预处理后予OG

6、D．AiR操作4h和8hLDH释放量显著减少。与ASICs阻滞剂相对应，依达拉奉预处理继以OGD—A／R操作可剂量依赖地减少损伤神经元LDH释放而产生与前者类似但更显著的保护作用。3与OGD—A／R组相比，依达拉奉预处理在各时点提高了BDNF和Bcl。2mRNA表达，且在OGD—A／R后8h作用最强；ELISIA检测提示依达拉奉在同一时间点使BDNF蛋白表达增多；Western．blot则显示在同一时间点依达拉奉在OGD．A／R后8h上调了Bcl一2蛋白表达；Caspase一3活性检测结果显示OGD．A／R极大地提

7、高了Caspase一3活性，依达拉奉预处理可明显降低这种Caspase．3活性的升高，且具有剂量依赖性。这种保护作用与ASICs阻断剂使用后相当。4与正常对照组比较，OGD—A／R神经元p-AKT水平显著提高，而依达拉奉或PcTX预处理后OGD．A／R则显著抑制了AKT磷酸化。5与正常对照组相比，OGD—A／R组或OGD—A／R并PcTX预处理组可引起p-ERKl／2活性轻度升高，而依达拉奉干预OGD—A／R后则可引起p-ERKl／2活性明显升高。这种作用可被MEK／ERK阻断剂万方数据博士学位论文中文摘要PD98

8、059(10gM)andU0126(5gM)阻断；6OGD．A／R诱导细胞损伤引起核染色质断裂和LDH释放增多。而依达拉奉预处理可在很大程度上防止细胞核形态变化和减少LDH释放。然而MEK／ERK阻滞剂PD98059和U0126预处理几乎完全抵消了依达拉奉对OGD．A／R损伤神经元抗凋亡能力。结论：1本研究首次发现依达拉奉能减轻缺氧复氧酸中毒诱导的神经毒性损