拼接和修复操作流程

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1、拼接和修复操作流程一：拼接1、引物登记：新引物到时，认真核对引物条数，按照基因名详细记录在引物登记本上。2、溶引物：将引物按顺序隔排排放到96孔平板上，（注意将GR基因两条重复的首尾引物各取出一条）向每管引物中加入300ul1*TE，并在每管管盖上标记出基因名称和引物序列号，注意不要错标。测序引物单独拿出来，交由测序人员保存，用时再溶解。3、振引物：将每板引物用涡旋震荡器震荡均匀，每板引物震荡时间不少于2分钟。4、写拼接方案：根据每条基因的引物条数对其进行分段，每段引物在12-18条之间，标示出各段的基因长度，并

2、依据基因的平均Tm值以及GC%选择一个合适的退火温度。一般退火温度稍高于平均Tm值，并根据GC%进行调整。若GC%大于60%时，要适量加入DMSO，最后写好基因的重叠延伸方案。5、混引物：按照拼接方案的分段方法，对各段引物进行混合，每条引物取5ul混合于1.5ml离心管中，充分震荡，混合均匀。6、准备反应：找到各段的首尾引物，按顺序与混合引物排列好，准备好一管灭菌水和总管。总管配置方法如下：5*pfuBuffer10ul*40400ulpfuDNA聚合酶0.6ul24uldNTP1ul40ulH2O13.4ul5

3、40ul注意配置总管是要确保每个成分的质量，每次新领取的成分用之前要检测。7、预扩增反应：反应体系如下：反应程序下：混合引物3ul1、94℃2min2、94℃20s3、退火温度+4℃20s总管25ul4、72℃14sH2O22ul5、94℃20s6、退火温度20s7、72℃14s-8、94℃20s9、55/60/6520s10、72℃14s11、72℃2min注意：配好反应体系后要离心，确保PCR管中没有气泡。如有气泡会影响Pfu酶的活性。其中2-4号程序是个降落PCR（TouchdownPCR）每个循环退火温度

4、下降1度，运行4循环，5-7号程序,运行8个循环，8-10号程序，运行8个循环。其中延伸温度根据片段大小决定，pfu的聚合速度为1kb/30s8、二次扩增反应：5反应体系如下：反应程序如下：预扩产物1ul1、94℃2min首引物2ul2、94℃20s尾引物2ul3、55/60/6520s总管25ul4、72℃视片段大小设定H2O20ul5、72℃2min2-4号程序，运行18个循环9、二扩产物检测：取2ul二扩产物进行电泳检测，若二扩产物有很好的纯度和浓度，可直接用其做模板进行下一步的重叠延伸。若二扩产物纯度不够

5、，则需要对其进行胶回收，回收完后做模板。若二扩产物浓度不够但很单一则需检测其首位引物的浓度。若二扩产物浓度及纯度都不好则考虑更改拼接方案。对拼接好的片段作好标记，对不理想的片段作好记录。10、第一轮重叠延伸：反应体系如下：反应程序如下：预扩产物1/2各1ul1、94℃2min首引物2ul2、94℃20s尾引物2ul3、55/60/6520s总管25ul4、72℃视片段大小设定-H2O19ul5、72℃2min2-4号程序，运行18个循环11、对重叠延伸产物跑回收胶，对其电泳情况进行记录，对好的片段进行胶回收。12

6、、以回收好的第一轮重叠延伸产物为模板，做下一轮重叠延伸，直至得到全长。二：基因修复1.基因修复的过程：（1）一般早上9：30－10：30之间，办公室下修复方案。修复方案下后，首先用修复方案本（不用修复本，因为在将方案誊写至修复本上时有一定出错率，直接用修复方案本可以保证不拿错质粒等）找到所需的原始质粒和所需基因的引物板。放于自己实验桌上。然后将方案誊写于修复本上（注意写好片段大小）。（2）将原始质粒稀释20倍。首先写好稀释质粒EP管的编号（标明1：20）（原始质粒一般用mark笔的粗头写，所以我们稀释质粒最好用m

7、ark笔的细头写，以便区分）。然后分别吸取原始质粒2uL至对应空管中，再加入38uL的无菌水（水要将原始质粒冲至管底）。最后在振荡器上振荡一下。（3）利用修复本将首尾引物排好顺序,至于板上。然后将稀释质粒相应的排好（同时核对是否出错）。写好PCR管，相应把引物和质粒加于相应PCR管中（稀释质粒、首末端引物各2mL）。加入25uL的总管。最后用无菌水将其配成50uL体系。（4）上PCR仪：因为各台PCR仪功效不一样，运行时间长短可能悬殊比较大。，所以尽量一批PCR都在一台机器上运行(一些难做的基因除外）。其GC％在

8、40％和60%之间的可以直接用60度退火；GC％在60％左右的片段，可以加入1uLDMSO（DMSO毒性极低，是一种水溶性的化合物，能溶解绝大多数有机化合物，减少DNA的二级结构，降低退火温度）在60度上退火，或直接在65度上退火；GC％在65％或更高一点的片段，可以加入2uL的DMSO在60度上退火，或加入1uLDMSO在65度上退火；对于GC％达到75％左右的基因可以