检测猪肺炎支原体lamp方法的建立与初与应用

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1、华中农业大学硕士学位论文检测猪肺炎支原体LAMP方法的建立与初与应用姓名：张灏申请学位级别：硕士专业：预防兽医学指导教师：何启盖201206检测猪肺炎支原体LAMP方法的建立与初步应用摘要猪肺炎支原体(Mycoplasmahyopneumoniae，Mhp)是引起猪气喘病的一种重要的病原，其还被认为是引起猪呼吸道综合症(PRDC)的一种重要的病原。其容易与其他病原如猪鼻支原体，多杀巴氏杆菌等继发感染。猪肺炎支原体的感染，根据支原体毒株毒力的高低和猪的个体情况，可造成慢性或者急性感染。猪肺炎支原体对不同年龄、性别

2、、品种的猪均能感染，尤其是哺乳仔猪和断乳仔猪易感性高，发病率和死亡率较高，引起严重的经济损失。猪肺炎支原体感染可以通过接种疫苗和药物治疗进行控制。是否能够准确的检测出致病病原，从而采取相应的措施，是疾病控制的重要的手段。病原分离培养是检测病原的最基本的方法，但是采用病原分离培养的方法来鉴定猪肺炎支原体存在着几个缺陷：一是猪肺炎支原体对生长条件要求很高，而且培养期较长，首次培养需要约10d才能长出肉眼可见的菌落；另一方面就是其生长经常被其他病原所掩盖，如猪鼻支原体。在目前为止，研究和应用了许多分子诊断方法，其中，

3、PCR方法仍是一种用途最广且也最常用的实验室分子诊断方法，而环介导恒温扩增法(LAMP)是一种新的，高效的核酸扩增方法，与PCR方法相比，其方法简便易行，耗时少，而且不需要利用实验室精密复杂的仪器和设备，只需要水浴锅就可以完成全程的反应。在本研究中，为了建立快速诊断Mhp的方法，以猪肺炎支原体保守的P36基因作为靶基因，建立了检测猪肺炎支原体的LAMP扩增方法，其主要结果如下：1．LAMP方法的建立LAMP扩增方法以P36基因作为靶基因，设计了4条特异性引物，反应温度为62℃，在60min内完成反应，PCR方法

4、同样以P36基因作为靶基因，在94℃变性，55℃退火，68℃延伸。建立PCR方法作为LAMP方法的验证与评价。结果均可通过电泳在凝胶成像系统上进行观察。通过采用倍比稀释对两种方法进行灵敏度的评价，结果显示PCR反应灵敏度为0．292ngMhpDNA，而LAMP反应的灵敏度为O．0292ngMhpDNA，在对465份临床肺组织和398份鼻拭子的检测中表明，LAMP方法能比PCR方法检测出更多的阳性，尤其是在检测含毒量较低的鼻拭子样本中，LMAP方法的检出率达到了19．6％而PCR方法仅有6．O％，所以LAMP方法

5、具有比PCR方法更高的灵敏度。2．LAMP方法的应用2．1LAMP方法对临床样品的检测对465份送检的临床肺组织以及采集的398份鼻拭子进行了LAMP方法的检测，样品分别来自于湖北，湖南，广西，广东，江西，山西，河南七个省市，再通过检华中农业大学2012届硕士学位论文测后发现，Mhp在所送检的各省份内均有不低的检出率，平均的检出率在40％．50％，有的省份如江西省甚至高达56．3％。再对检测的样本进行日龄的分类，我们可以得出，与育肥猪的检出率最高，高达66．7％，哺乳猪最低，只有11．2％，因此在对Mhp的预防

6、和治疗时，要加大对育肥猪Mhp的治疗与控制。在对是否免疫过Mhp疫苗检出率的统计中，我们发现未免疫过Mhp疫苗的猪群，其检出率为29．1％，而进行过疫苗免疫的猪群检出率则降低为13．3％，因此可以推断，对猪群进行Mhp的疫苗免疫能降低Mhp的检出率。2．2LAMP方法检测人工感染Mhp的排毒情况猪肺炎支原体的人工感染采用气管人工感染，毒株为江苏省农科院馈赠168标准强毒株，攻毒剂量为(1×1010CFU／mL)2mL，攻毒后于7d，14d，21d，28d采集鼻拭子进行排毒检测。鼻拭子的检测结果表明，猪群发病的时

7、间与检出排毒的时间基本是一致的。观察表明猪群于18．21d发病，21d的检测结果中就可以发现大部分猪有了排毒，28d可以发现所有发病猪均有排毒，而且从人工感染的14d开始就可以检测出排毒。2．3Mhp与PCV2混合感染检测情况在猪肺炎支原体与猪圆环病毒2型(PCV2)的混合感染的统计中，由于PCV2也能在肺脏中检测出来，因此采用了PCR方法对同样的肺组织样本进行了PCV2的检测。检测结果表明，Mhp和PCV2的混合感染率达到了14％，而且PCV2的单独感染率也达到了26．2％，因此在控制Mhp感染的同时，对PC

8、V2的预防与控制同样也很重要。关键词：猪肺炎支原体，环介导等温扩增法，PCR，流行病学调查2检测猪肺炎支原体LAMP方法的建立与初步应用AbstractMycoplasmahyopneumoniae(Mhp)isallimportantpathogeniccauseswineenzooticpneumonia．ItWasconsideredanimportantpathogentoca