伴放线放线杆菌磷脂酰胆碱致病机制的初步研究

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1、南方医科大学2010级博士学位论文伴放线放线杆菌磷脂酰胆碱致病机制的初步研究PreliminaryResearchonPhosphorylcholineinPathogenesisofAggregatibacteractinomycetemcomitans课题来源：白选课题学位申请人王勤导师姓名曹虹教授章锦才教授专业名称病原生物学培养类型学术型培养层次博士研究生所在学院公共卫生与热带医学学院2013年4月03日广州博士学位论文伴放线放线杆菌磷脂酰胆碱致病机制的初步研究博士研究生：王勤f

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3、IIIiiiiiiiiiiiilUllIIIIIIIIIIII『指导教师：曹虹教授章锦才教授舅61璺771摘要研究背景伴放线放线杆菌(Aggregatibacteractinomycetemcomitans，Aa)是近年来牙周炎细菌病因学研究领域中的热点，是一种公认的牙周致病菌，特别是与侵袭性牙周炎关系密切。Aa以生物膜形式寄居在人类口腔中，在生长期间排出许多膜泡，内含内毒素、白细胞毒素和骨吸收因子等毒性因子。其产生的内毒素及以自细胞毒素(1eukotoxin，LT)为代表的细胞致死膨胀毒素(cytolethaldistend

4、ingtoxin，CDT)等可溶性介质能够降低宿主抵抗力，导致牙周组织的迅速破坏，在牙周炎的发生与发展过程中起重要作用。磷脂酰胆碱(phosphorylcholine，PC)是动植物细胞的必需组分，富含于神经组织，特别是髓鞘和蛋黄中。研究发现PC存在于多种病原菌中，包括革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。目前的研究表明PC可能是病原菌的重要致病因予。目前，磷脂酰胆碱在大部分病原菌的致病机制中的作用尚不清楚。通过对肺炎链球菌和流感嗜血杆菌等的研究发现，细菌细胞壁的胆碱成分通过与内皮细胞表面的血小板活化因子受体(Plateletactiv

5、atingfactor-receptor，PAFR)结合来介导侵袭。PAFR分布于多种内皮细胞和上皮细胞表面，PAFR的天然配体血小板活化因子(Plateletactivatingfactor，PAF)含有磷脂酰胆碱，细菌细胞壁中的磷摘要脂酰胆碱可通过模拟血小板活化因子，与血小板活化因子受体结合而帮助细菌侵入宿主细胞。以往的研究发现在口腔龈上和龈下菌斑中大多数的细菌可以表达PC，如口腔链球菌、具梭核杆菌、伴放线放线杆菌、各种放线菌属及奈瑟菌属等。Schenkein等人发现携带PC的A丑菌株与不携带PC的Aa菌株致病力有明显差异

6、。提示PC可能是Aa导致牙周病发生发展的一个重要的致病因子。然而，目前对于Aa细菌株上含有的磷脂酰胆碱通过哪些信号通路来介导了Aa对宿主细胞的黏附侵袭尚未见有人报道。本课题拟通过分离临床Aa菌株，筛选出PC阳性的Aa菌株，探讨PC介导Aa黏附侵袭宿主细胞的可能机制，为研究Aa的致病机制提供一定的理论基础。一、PC阳性的Aa菌株的分离及鉴定采集侵袭性牙周炎患者的牙周袋内的非附着性菌斑，接种于选择性培养基TSBV平板上，观察菌落的形态挑选可疑菌落，根据触酶试验阳性、革兰染色实验阴性及16SrDNA鉴定，筛选出伴放线放线杆菌临床分离

7、株7株。将所得的临床菌株全细胞进行聚丙烯酰胺凝胶(SDS—PAGE)电泳，考马斯亮蓝染色后观察细菌蛋白的表达。并采用蛋白免疫印迹法(WesternBlot)检测细菌表面蛋白对磷脂酰胆碱单克隆抗体TEPC一15的反应情况，最终筛选出磷脂酰胆碱阳性表达的Aa菌株1株。二、PAFR在PC阳性Aa菌株致病过程中的作用研究1．PC对细菌黏附和侵袭的影响为了研究PC的表达在Aa黏附和侵袭人脐静脉血管内皮细胞(humanumbilicalveinendothelialcells，r_fUVEC)过程中的作用，我们采用抗PC的特异性单克隆抗体

8、TEPC一15抗体预处理HUVEC30min后，分别与PC阳性和阴性的Aa临床分离株在37。C共孵育4h后，观察细菌的对HUVEC的黏附和侵袭情况。结果发现PC阳性的AaI临床分离株的黏附力和侵袭力均发生了显著卜．降(尸<0．05)，分别为对照组的31．87+4．22％和24．63+3．55％。而用TEPC．15抗体预博士学位论文处理细胞以后，PC阴性的Aa对HUVEC的黏附力和侵袭力则无显著差异(胗0．05)。2．PAFR对细菌黏附侵袭的影响为了研究PAFR是否参与了Aa对HUVEC的黏附和侵袭过程，我们利用PAFR拮抗剂(

9、CV3988)和抗PAFR抗体作用于HUVEC30min后，进行了细菌的黏附和侵袭实验。结果发现lOOnm，200nm和500rim的PAFR拮抗剂预处理HUVEC，显著减少了PC阳性Aa对HUVEC的黏附和侵袭沪<0．001)，黏附率分别为对照组的36．29士3．52％，1