低磷胁迫下草酸青霉菌bk溶磷的分子机制

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1、硕士学位论文低磷胁迫下草酸青霉菌BK溶磷的分子机制MolecularMechanismofPhosphateSolubilizationtoPhosphateDeficientStressinPen纪iIliumOxalicumBK学号：21118107完成日期：2Q!．垒堡．墨旦一．大连理工大学DalianUniversityofTechnology大连理工大学学位论文独创性声明作者郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下进行研究工作所取得的成果。尽我所知，除文中已经注明引用内容和致谢的地方外，本论文不包含其他个人或集体已经发表的研究成果

2、，也不包含其他已申请学位或其他用途使用过的成果。与我一同工作的同志对本研究所做的贡献均已在论文中做了明确的说明并表示了谢意。若有不实之处，本人愿意承担相关法律责任。学位论文题目：篮盛丛迫王蔓堕壹鐾．苴里坠鲨盛鲍金王扭剑作者签名：主避日期：丝!生年—厶月—生日入连理工大学硕士学位论文摘要磷是限制植物生长的主要营养元素之一。土壤磷素丰富，但大部分以难溶性磷形式存在，供植物利用的有效性很低，利用微生物活化土壤难溶态磷是长期以来的研究热点。目前普遍认为，分泌有机酸是微生物溶解难溶性无机磷源的主要机理，但广泛的研究结果(尤其是对于溶磷真菌)大都集中在有机酸代

3、谢产物分析，研究手段也仅限于生物化学和定性定量检测。关于溶磷过程的分子表达调控机制至今未取得明确进展，这极大的影响了溶磷微生物作为生物磷肥在农业生态系统中的应用。本研究从筛选高效溶磷真菌出发，定性定量分析了菌体溶磷过程中有机酸代谢机制；研究了有机酸代谢网络通路中溶磷功能相关的两个关键基因对低磷胁迫的表达响应模式，初步阐明真菌响应磷胁迫压力的分子作用机理。取得的主要成果如下：以难溶性磷酸钙为唯一无机磷源，从番茄根际土壤中筛选出一株高效溶磷真菌BK，初步溶磷能力为685mg／L。通过对BK菌体DNA进行ITS序列分析，确定菌株BK属于草酸青霉菌属(Pe

4、nicilliumoxalicum)。通过优化碳源和氮源底物培养条件，极大提高了BK的溶磷能力，最大溶磷能力为853mg／L。在Ca30'04)2为唯一磷源、底物优化后的培养条件下，明确了BK的溶磷能力随pH下降逐渐增强，第5天时溶磷能力达到最大值，培养基pH值降低至2．5，初步推断有机酸的产生参与了草酸青霉菌BK溶磷的主要机制。建立了高效液相色谱(HPLC)分离BK菌溶磷代谢产物最佳条件：流动相为l％甲醇．0，02mol／LKH2P04(pH2．6)缓冲液，流速为0．5ml／min，进样量10pl，检测波长210nlTI，柱温25。C。利用该条件

5、对低磷胁迫和非磷胁迫下菌体发酵液中有机酸的动态变化进行了定性定量分析。色谱结果表明，磷胁迫使得草酸青霉菌BK产生约4倍于可溶磷条件的苹果酸，并极大减少了草酸的分泌，进一步说明了苹果酸代谢积累在草酸青霉菌BK溶磷过程中发挥着主要作用。研究了两个溶磷相关的关键功能基因线粒体苹果酸脱氢酶(mMDH)和富马酸酶(Fumarase)基因在低磷胁迫和非磷胁迫条件下表达响应模式。实时荧光定量PCR检测结果表明，mMDH基因的转录水平从第3天开始升高，最高可达到非磷胁迫条件下的8．7倍。Fumarase基因从第5天开始表现出过量表达，为非磷胁迫下的1．9倍。同时这

6、两个基因编码的蛋白酶活性与基因转录水平变化趋势基本一致。因此，本论文首次在分子水平上阐明了磷胁迫压力下，草酸青霉菌BK可通过提高编码苹果酸合成反应的催化酶基因表达，增加苹果酸的分泌和积累，从而响应环境磷胁迫压力。关键词：草酸青霉；低磷胁迫：有机酸；线粒体苹果酸脱氢酶；富马酸酶；分子机制低磷胁迫下草酸青霉菌BK溶磷的分子机制MolecularMechanismofPhosphateSolubilizationtoPhosphateDeficientStressinPenicilliumOxalicurnBKAbstractAsoneofthemajo

7、rlimitingnutritiveelementsinplantsgrowth，phosphorus(P)areabundantinsoil，butmostofthemareintheformofinsolubleinorganicphosphorusandthebioavailableforplantisinefficient．Foralongtime，microorganismsthatarecapableofmobilizingPintoavailableformswereusedinfieldsasbiofertilizers，Itisg

8、enerallyacceptedthattheproductionoforganicacidsisthemainmecha