calibrin-z对鸡坏死性肠炎防治效果的研究

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目录中文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．IAbstract⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．III引言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．11．1禽坏死性肠炎研究进展⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯11．1．1病原体⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯11．1．2发病机制⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯21．1．3发病因素⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯31．1．4流行病学⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯51．1．5症状⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯51．1．6病理变化⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯51．1．7疾病预防措施⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯51．2魏氏梭菌的研究⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．61．2．1生化特性⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯61．2．2魏氏梭菌的毒素类型⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯71．2．3魏氏梭菌病的流行⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯71．2．4魏氏梭菌病的危害⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯71．2．5魏氏梭菌毒素研究进展⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯81．3蒙脱石吸附剂的研究进展⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一91．3．1理化性质⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一91．3．2使用效果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．101．3．3现代技术的影响⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．111．4试验目的和意义⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯112材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．122．1材料⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯122．1．1试验仪器⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．122．1．2主要试剂及试剂盒⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．122．1．3试验地点⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．132．1．4魏氏梭菌⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯132．1．5实验动物⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．13 2．1．6基础日粮⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．132．1．7主要试剂的配制⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．142．2实验步骤⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯142．2．1魏氏梭菌的分离⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．142．2．2魏氏梭菌的鉴定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．152．2．3坏死性肠炎模型建立⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．193试验结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯233．1魏氏梭菌增菌培养结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯233．1．1血平板结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．233．1．2菌体形态和运动性观察⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．233．1．3分离菌株PCR鉴定及测序结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯243．2动物实验结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯243．2．1临床症状及剖检病变⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．243．2．2肠粘膜病理组织结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．253．2．3新城疫抗体水平结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯273．2．4免疫器官指数⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．283．2．5对肉鸡肠道发育影响⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．293．2．6内脏毒素检测结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．354讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．355结论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯36致谢⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．45硕士期间发表论文⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一46 山东农业大学硕士学位论文中文摘要鸡坏死性肠炎(NecroticEnteritis)又称鸡肠毒综合症，是在多种诱发因素下，由魏氏梭菌引起的一种急性肠道传染病。肉鸡坏死性肠炎具有很高的发病率与死亡率，有些病例平均每天的死亡率高达1％以上，并造成食品安全隐患。随着肉鸡养殖业的快速发展，坏死性肠炎的发病率呈逐年上升趋势，严重制约肉鸡养殖业的健康发展。Calibfin—Z是由美国某公司研制的一种新型蒙脱石吸附剂。本试验从鸡坏死性肠炎的临床典型病例中分离、鉴定魏氏梭菌，利用分离细菌感染肉仔鸡建立人工坏死性肠炎模型，通过饲料中添加Calibrin．Z研究其有无控制坏死性肠炎发生的功效，能否降低该病对肉鸡养殖业带来的危害。本实验选用576只1日龄健康AA肉仔鸡，随机分成6个处理组，每个处理8个重复，每个重复12只鸡。试验l组只接种魏氏梭菌，日粮中不添加Calibfin．Z。试验2组日粮中只添加0．1％Calibfin．Z，不接种魏氏梭菌。3．5试验组日粮中分别添加0．1％、0．2％、0．3％的Calibrin．Z并接种魏氏梭菌。饲养时间共28天，第一阶段为1．14天，第二阶段为15．28天。第14天，试验1组和3．5组口鼻接种魏氏梭菌(3x108cfu／只)。分别于第17、21、28日龄时，每个重复随机选3只鸡采血并取胸腺、法氏囊、脾脏，称重，计算免疫器官指数，取小肠10％福尔马林固定，石蜡切片，在每个病料的特定部位做连续切片，HE染色，镜检观察肠管发育状况。用光学显微镜结合电子成像系统软件测量记录小肠绒毛长度、隐窝深度，计算绒毛长度和隐窝深度的比值。结果表明：试验1组抗体水平低于对照组及2．5试验组，差异显著(P<0．05)，对照组与2．5试验组之间差异不显著。免疫器官指数试验l组低于对照组及2．5试验组，差异显著(P<0．05)。对照组与2—5试验组之间均无明显差异。从肠道病理切片可以看出，对照组和试验2组无明显病变，试验1组见明显的坏死性肠炎病变，3．5试验组只见极轻微的病变。小肠绒毛长度以及与隐窝深度的比值试验1组低于对照组及2．5试验组，差异显著(P0．05)。17日龄时，对照组及2．5试验组新城疫抗体水平分别是试验1组的1．39、1．40、1．22、1．35、1．36倍。21日龄时，分别是试验1组的1．56、1．60、1．40、1．45、1．44倍。28日龄时，分别是试验1组的1．40、1．40、1．33、1．47、1．48倍。27 Calibrin．Z对鸡坏死性肠炎防制效果的研究表5Calibrin．Z对不同日龄肉鸡ND抗体水平的影响Table5InfluenceofCalibrin—ZinfectiononantibodyreactiontoNDVvaccines·每列中字母相同者表示差异未达显著水平(P>O．05)，字母不同者表示差异达显著水平(P<0．05)。Thesamealphabetsinrightsideofthesamelistshownosignificance(P>0．05)，onthecontrary,havingsignificance(P<0．05)图4Calibrin．Z对不同日龄肉鸡ND抗体水平的影响囹对照蛆■试验1组口试验2组口试验3组一试验4组四试验5组Fig．4InfluenceofCalibrin-ZinfectiononantibodyreactiontoNDVvaccines3．2．4免疫器官指数免疫器官指数见下表，由表6可知，试验2组免疫器官指数最高，对照组与2—5试验组，免疫器官指数均显著高于试验1组(PO．05)，字母不同者表示差异达显著水平(P<0．05)。——ThesamealphabetsinrightsideoftheSalTlelistshownosignificance(P>0．05)，onthecontra／'y,havingsignificance(P<0．05)．崔萼。。N艨，忆絮r---iN雠，比絮o。N琶鉴霎霎可t"---dv----IN鉴厘呵130N图5Calibrin-z对不同日龄肉鸡免疫器官指数的影响圈对其召组■试验1组口试验2组口试验3组■试验4组囡试验5组Fig·5EffectsofCalibrin。Zonrelativeimmuneorganexponentofdifferent-timechickens(g／kg)3．2．5对肉鸡肠道发育影响对肉鸡肠道发育影响见表7、8、9。由表7、表8、表9试验结果可知，各段小肠的绒毛长度，对照组及2-5试验组与试验1组之间差异显著(P<0．05)。17日龄时，十二指肠绒毛长度分别为试验1组的1．28、1．29、1．16、1．23、1．23倍。空肠绒毛长度分别为试验1组的1．41、1．46、1．36、1．39、1．40倍。回肠绒毛长度分别为试验1组的1．66、1．79、1．27、1．28、1．28倍。21日龄时，十二指肠绒毛长度分别为试验1组的1．26、1．30、1．22、1．28、1．27倍。空肠绒毛长度分别为试验l组的1．41、1．50、1．41、1．43、1．46倍。回肠’043210^∞絮暑)掣斟删世髻=基譬高善警= Calibrin．Z对鸡坏死性肠炎防制效果的研究绒毛长度分别为试验1组的1．66,1．60、1．32、1．39、1．43倍。28日龄时，十二指肠绒毛长度分别为试验1组的1．17、1．27、1．08、1．12、1．13倍。空肠绒毛长度分别为试验1组的1．23、1．35、1．25、1．67、1．27倍。回肠绒毛长度分别为试验1组的1．56、1．61、1．52、1．55、1．52倍。在各日龄段，试验1组各段小肠的隐窝深度最大，与其它各组差异显著(Po．05)，字母不而吾夏牙磊季夏量云事夏平石荀丽；i■一Th。58m。81phabetSinrightsideofthesamelistshownosignificance(P>0．05)，onthec。ntrary,havingsignificancerP<0．05)—一、昱、_，800600400蜊半2000gR口：田：hⅨ鼎r．．--i烈茁gCq承茁黑n韶茁囊吲烈整烈∞承茁图6Calibrin—Z对十二指肠绒毛长度影响Fig·6EffectsofCalibrin-Zonrelativeduodenumvilluslength囹l7天一21天口28天 Calibrin-Z对鸡坏死性肠炎防制效果的研究导§磊暑一餐鼍妄N髻0，．．：妻∥：祭X三!t祟‘，．．：三；口g苫图7CMibrin．Z对十二指肠V／C的影响Fig．7EffectsofCalibrin．-ZOilrelativeduodenumV／C囵：7王■2二天口2si表8Calibrin·z对雏鸡空肠绒毛长度和隐窝深度(1am)的影响Table8EffectsofCalibrin-Zonrelativejejun项目组别17天21天28天绒毛／隐窝对照组试验1组试验2组试验3组试验4组试验5组6．14+0．4383．28+0．6：267．49士o．5644．97土0．44。5．36士0．71。5．28士0．5l。6．31士0．28”3．14士0．37b7．55士0．5685．05士0．41。5．70士O．39。5．27土0．24。5．35士0．53。3．87+0,3067．43士O．6285．22士0,29。4．98士0．33。6．41士0．47'。+每列中字母相同者表示差异未达显著水平(P>0．05)，字母不同者表示差异达显著水平(P<0．05)。Thesamealphabetsinrightsideofthesamelistshownosignificance(P>0．05)，onthecontrary,havingsignificance(P<0．05)32堪控∞8542o口》v 山东农业大学硕士学位论文，-、昱、—一塑500400300200100O鼎团：口口：扣限鼎H静茁黑N烈整骤n薛蟠黑寸承茁黑价承强图8Calibrin．Z对空肠绒毛长度影响Fig．8EffectsofCalibrin·Zonrelativejejunvilluslength囹17天121天口28天豢鬻r■囊臻薏薹黍v芦魏l囊耄，i∥嚣z=+墨纛i妻藩。‘{塞避Vj囊i鋈瀚妻．囊iY，‘，一一jt，^缓尊'”。1}_、ij?～i～圈17大一，1天口28天项目组别17天2l天28天绒毛长度对照组试验1组试验2组试验3组试验4组试验5组341．02士136．5。205．23+97．276368．89+16．238261．21+73．13ab263．75+21．22ab262．21+36．97ab357．12A：16．553245．28+97．276391．87+15．248323．24+43．144340．45+21．028351．22+36．973386．06+11．178247．10+45．066396．90+11．588376．48+85．098383．73+69．174375．99+28．258j—H||I_L¨，|| —————————————————壁些翌!三型塑堑幽垄堕型整墨塑堕窒——————————————i丽历■——————————=-—————————r——～一对照组71．33士21．238瓦西瓦而了尹-———页函五两百r隐窝深度试验1组84．40“3．81曲85．41士33．61a107．10士51．79bc试验2组试验3组试验4组60．52士34．52b61．25土24．22b65．61“8．99b75．67士59．33883．39士22．42898．82士54．48c71．57士42．12871．86士68．61&b89．29士51．24a试验5组72．78士69．68872．79士56．23a88．18士77．59a对照组4．78士o．53a■疆矗五甭F—————了再五iF一试验1组2．43士O．6862．87士0．69b2．31士0．28b绒毛／隐窝试验2组试验3组试验4组6．10士0．4986．40土0．4386．05士0．56a3．45士O．52。3．88士0．57bc3．81士0．37bc3．69士0．63。4．74士0．26。4．30士0．45c试验5组3．60士0．48。4．83士0．31c4．26士0．44c111。8am。alphabetsinrightside。fthesamelistsh。wn。significance(P>0。05)，。nthecontrary,havingsignificance(P<0．05)600—、昱400、一例200业0黑R口：口口：扣Ⅸ鼎一承筇黑C、】烈笛鼎0'3静蟠黑弋，'烈整图10Calibrin．z对回肠绒毛长度影响黑Lf)承茁Fig．10EffectsofCalibrin—Zonrelativeileumvilluslength图17天W21天[-128天j||||||囊n鼢‘鬻黍—黑囔一蕊攀-鬟溪雾纂：簇鬻篱图17天篓t§蒸雌1天鹁[卫8大爹鎏蠢豢 山东农业大学硕士学位论文3．2．6内脏毒素检测结果阳性对照孔平均值：(1．180+1．270)／2=1．225阴性对照孔平均值：(O．850+0．710)／2=0．78对照组结果成立，根据试验结果，所有检测样品都属于阴性。表lO魏氏梭菌毒素检测结果Table10Clostridiumwestergrentoxinsresults组别17天21天28天鱼翌坠笆卫曼!!!塑!!!里尘鱼型：!堡塑!翌型：!!堕垒型!生堕!翌受：!ig塾堡垒型对照组0．749-“)．002‘0．723士0．002‘O．809-士o．00Io试验1组0．837士0．00660．871=q)．00260．905士-0．0036试验2组0．684士0．001。0．692--士0．001。O．698土0．001。试验3组0．742-士0．005。0．762士0．001。0．654士0．008。试验4组0．728士0．003。0．795士0．0024O．685士0．004。试验5组0．760-x-0．00l。0．796士0．001‘0．792-+0．001。·每列中字母相同者表示差异未达显著水平(P>0．05)，字母不同者表示差异达显著水平(P<0．05)。Thesamealphabetsinrightsideofthesamelistshownosignificance(P>0．05)，onthecontrary,havingsignificance(P<0．05)．4讨论魏氏梭菌分离检测结果表明自临床病例采集病料分离到的细菌为A型魏氏梭菌。所分离的魏氏梭菌后期接种实验鸡只后均出现了不同程度的坏死性肠炎病变，尤其是单纯接种细菌的试验1组眼观及镜检病变都极为典型，所观察到的病变与LahtiP等人所表述的A型魏氏梭菌感染引起的鸡坏死性肠炎的表述完全相符(LahtiP，eta1．，2008)。这也进一步证明，分离的细菌是一种致病性很强的魏氏梭菌。抗体水平的高低能反映机体对特定抗原特异性免疫反应的强弱。本实验结果显示，对照组及2．5试验组新城疫抗体水平均高于试验l组，且差异显著(P