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1、上海交通大学博士学位论文磁性粒子表面修饰及其在功能性小分子作用组学研究中的应用博士生：郭微学号：0071709015专业：药剂学指导教师：徐宇虹教授上海交通大学2012年4月万方数据上海交通大学博士学位论文DoctoralthesisofShanghaiJiaoTongUniversitySurfacemodifiedmagneticparticlesinthestudiesofsmallmoleculeinteractomesPh.DCandidate:WeiGuoIDNo.:0071709015Specialty:Pharmac
2、euticsAdvisor:ProfessorYuhongXuShanghaiJiaoTongUniversityApril,20122万方数据上海交通大学博士学位论文磁性粒子表面修饰及其在功能性小分子作用组学研究中的应用摘要本文介绍了以磁性粒子为载体,通过其表面的化学基团分别连接天然产物石杉碱甲（HupA）和二腺苷四磷酸（Ap4A）,经过磁分离,分别从噬菌体cDNA展示库和哺乳动物的脑组织裂解液里筛选HupA的靶点,以及从原核生物细胞裂解液和真核生物组织裂解液里筛选Ap4A的靶点的研究。通过毛细管电泳技术分析了筛选出的特异性噬菌体
3、与HupA的结合,又通过表面等离子共振技术验证了经体外克隆表达的筛选到的特异性噬菌体基因所在蛋白与HupA的结合。本论文首先采用化学共沉淀的方法,以用乳酸聚合而成的醇酸聚合物为高分子模板,制备出表面带有羧基的磁性粒子。通过羧基与其它化学基团的反应,可以有效地连接各种生物活性分子或药物，且连接后的磁性粒子可以稳定存在于水溶液中并具有顺磁性，因而在生物医学分离等领域具有潜在的应用价值。功能性小分子,特别是天然产物,是现代医药的主要来源,在帮助人类战胜病魔的过程中,发挥着举足轻重的作用。根据天然产物的来源我们往往可以判断出它们的功能,而且
4、在一些疾病模型上也部分验证了其治疗作用,但大多天然产物没有明确的分子靶点，有些作用机制尚不清楚，这就为寻找和合成天然产物的类似物或替代品或更优v万方数据上海交通大学博士学位论文产品,以及进一步揭示疾病的病因等造成一定的困难。因而结合已有的药物靶点筛选技术,建立更行之有效的天然产物靶点筛选方法以找到其可能的未知作用靶点,成为加速现代医药进程的关键步骤。本论文首先将我国传统中草药蛇足石杉的有效成分HupA连接在磁性粒子的表面，分别从噬菌体cDNA展示库和哺乳动物脑组织裂解液中进行靶点筛选。通过几轮磁生物淘洗，亲和筛选出二种重复出现的对H
5、upA特异性结合的噬菌体。通过PCR、基因测序和序列比对，在基因库中找到特异性噬菌体展示基因所在的蛋白，并通过毛细管电泳技术检测了两种特异性噬菌体以及一种非特异性噬菌体与HupA的体外结合，结果表明筛选出的两种特异性噬菌体和HupA之间具有一定的结合，而非特异性噬菌体与HupA基本没有结合,从而排除了筛选到的噬菌体是磁性粒子非特异性吸附的结果的可能性。再通过原核表达的方法,对其中一种特异性噬菌体展示基因所在的功能性蛋白-线粒体NADH脱氢酶subunit1进行了体外表达及纯化,并通过表面等离子共振技术检测了纯化后的蛋白与HupA之间
6、的结合,得到了二者之间的结合常数,说明二者之间确实存在一定的相互作用。通过真核组织裂解液的筛选，又一功能蛋白mitochondriaATPsynthase被重复筛选出来。所有这些结果，再结合他人关于HupA功能的研究，在很大程度上说明HupA很可能通过对神经细胞线粒体功能的调节来治疗阿尔茨海默症（AD），而线粒体的某些功能蛋白，比如NADH脱氢酶subunit1和ATPsynthase则有可能成为HupA的新的作用靶点。具体地说，通过与这些酶相互作用，HupA很可能作为他们的激动剂vi万方数据上海交通大学博士学位论文改善其活性，从而
7、促进氧化呼吸链的电子传递，增加ATP的产生和能量的新陈代谢，来满足AD以及其它神经退行性疾病病人的受损神经元对于能量的需求。除了HupA以外，我们还在体外化学合成了带有生物素的Ap4A，并将其连接到表面包被有链霉亲和素的磁性粒子上。同样通过磁生物淘洗，分别从大肠杆菌细胞和哺乳动物组织裂解液里筛选Ap4A的结合蛋白。对于原核筛选来说，一个特异性的蛋白条带在六次筛选过程中均被重复筛选到；而对于真核筛选来说，4个特异性的蛋白条带被重复筛选到。经质谱鉴定，Ap4A的已知靶点GroEL被筛选出来。这不仅表明磁生物淘洗方法在功能性小分子靶点筛选
8、中的可行性，而且加大了其它被筛选出的蛋白,特别是IMPdehydrogenase和部分真核热休克家族蛋白（Hsp）成为Ap4A未知靶点的可能性。可以说本部分实验是磁性粒子在天然产物靶点筛选中的又一个尝试性的应用，也是对将此方法应用在H
