针灸提高大鼠对疫苗的免疫效应及延缓衰老的实验研究

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1、湖北中医药大学博士学位论文针灸提高大鼠对疫苗的免疫效应及延缓衰老的实验研究姓名：肖凌申请学位级别：博士专业：针灸推拿学指导教师：王华20120508中文摘要目的：检测“双固一通”电针法延缓D一半乳糖诱导衰老模型大鼠的免疫衰老(实验一)；探讨“双固一通’’针灸法对不同浓度百白破疫苗免疫大鼠增强其疫苗免疫效应的作用，摸索针灸提高疫苗免疫效应的最佳疫苗浓度(实验二)；检测D一半乳糖诱导衰老模型大鼠衰老相关指标的改变，鉴定免疫衰老模型构建成功(实验三)；将百白破疫苗免疫衰老模型及正常大鼠，采用“双固一通”

2、针灸法处理，探讨针灸是否能提高大鼠对疫苗的免疫应答效应，发挥疫苗佐剂的作用及延缓免疫衰老的效应(实验四)。方法：实验一：雄性SPF级SD大鼠40只，随机取30只大鼠经皮下注射D一半乳糖42d制作衰老大鼠模型，剩余1O只为正常对照组。造模结束后模型组再随机分为双固一通组(“关元’’、“后三里”穴接电针，“百会’’穴毫针针刺)、针刺对照组(“委中"、“水分"穴接电针，“印堂”穴毫针针刺)、衰老模型组，每组1o只大鼠。经3周治疗后处死动物检测脾脏指数、胸腺指数、流式细胞法检测CD8+T细胞占T细胞的百分

3、率及CD8+CD28一T占CD8+T细胞的百分率。实验二：雌性SPF级Wistar大鼠48只，随机分组为六组：1／10疫苗免疫针灸组、1／10疫苗免疫对照组、1／20疫苗免疫针灸组、1／20疫苗免疫对照组、1／40疫苗免疫针灸组、1／40疫苗免疫对照组。每组注射相应浓度的百白破疫苗，针灸组电针刺激大鼠“后三里竹、“百会”、“关元竹穴，并施以艾灸处理3周，第5周取材，心脏采血分离血清，用Veto细胞法测定白喉抗毒素的效价；MTS比色法检测脾细胞特异性增殖能力；流式细胞法检测CD4+T细胞／CD8+T

4、细胞比值；RT-PCR检测脾细胞热休克蛋白7o(HSP70)mRNA的相对表达量(同GAPDH比较)。实验三：雌性SPF级WiStar大鼠2o只，随机取lO只大鼠皮下注射D一半乳糖42d制作衰老大鼠模型，剩余10只为正常对照组。造模结束后，进行水迷宫实验，实验结束后处死动物，检测血清超氧化物歧化酶(SOD)的活性及甘油三脂(TG)，胆固醇(CHOL)的含量，RT-PCR检测脾细胞HSP70mRNA的相对表达量。实验四：雌性SPF级WiStar大鼠40只，随机分成4组：模型免疫针灸组、模型免疫对照组

5、、正常免疫针灸组、正常免疫对照组。模型免疫组用D一半乳糖颈背部皮下注射6周，构建衰老大鼠模型。正常免疫组注射等量生理盐水，第7周所有大鼠注射百白破疫苗，电针刺激大鼠“后三里’’、“百会’’、“关元"穴，并施以艾灸处理3周，针灸治疗结束后再继续喂养2周，至第12周处死所有大鼠，心脏采血，分离血清检测SOD活性、血脂和蛋白含量，用Vero细胞法测定白喉抗毒素的效价；流式细胞法检测CD4+T细胞／CD8+T细胞比值；RT-PCR检测脾细胞HSP70mRblA的相对表达量。结果：实验一：衰老模型组大鼠脾脏

6、指数、胸腺指数低于正常对照组(尸

7、+T细胞比值降低得更为显著(尸<0．05)。实验二：1／20疫苗免疫针灸组的抗体效价明显高于1／20疫苗免疫对照组(尸<0．01)；1／10疫苗免疫针灸组和1／10疫苗免疫对照组抗体效价均高，无明显差异；而1／40疫苗免疫针灸组和1／40疫苗免疫对照组抗体效价亦无明显差异。脾细胞增殖实验表明疫苗本身对细胞有毒性，不适宜做特异性增殖实验，流式细胞法检测1／20疫苗免疫针灸组CD4+T细胞／CD8+T细胞比值较其对照组略有增加(尸>0．05)；RT-PCR结果显示1／20疫苗针灸组脾细胞HSP70mR

8、NA的相对表达量较其对照组略有升高(尸>O．05)。实验三：衰老模型组大鼠水迷宫实验(空间探索实验)经过平台次数Il(尸