实验十二 水的标准定性分析及选择性培养基

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1、Gen.Microbiol.Lab.,2008Dept.Agri.Chem.,NTU實驗十二水的標準定性分析及選擇性培養基◎Exp.32.StandardQualitativeAnalysisofWater一、目的：1.判定水質樣本中是否有大腸桿菌群(coliformbacteri)的存在。2.獲得在樣本中出現微生物之最確數指標(themostprobablenumberindex,MPNindex)。3.確定在推斷試驗(presumptivetest)出現陽性反應的試管中，確有大腸桿菌群(coliformbacteria)的存在。4.確認水樣中的大腸桿菌群(coliformba

2、cteria)。二、原理：水質分析方法如最確數法(Themostprobablenumbermethod,MPNmethod)及濾膜過濾法(Themembranefiltermethod)均常被用來做例行的水質檢驗，以確保飲用水之安全。本實驗使用最確數法，又稱為多管測試法(Themultipletubemethod)，因為大腸桿菌群(coliformbacteria)可以醱酵乳糖，同時產生酸及氣體(CO2)，故可使用乳糖醱酵培養基(lactosefermentationbroth;LB)來測試，並在試管中倒置一小管(Durhamtube)，以收集放出的氣體。除了乳糖，培養基中並含

3、有膽鹽(bilesalt)，以抑制coliformbacteria以外之其他微生物生長。最確數法分為三個測試階段，即推斷試驗(Presumptivetest)、確認試驗(Confirmedtest)及完成試驗(Completedtest)【參考課本p.180-183】。對於每一水樣的測試至少使用6支試管(使用愈多試管，其敏感度愈高)，分成三組：LB2×-10ml、LB1×-1ml及LB1×-0.1ml各三支，測試時在每支試管中，加入與培養基等量的水樣。培養過後，若有氣體出現，則可作為coliformbacteria存在的假設性證據(presumptiveevidence)，並以其

4、出現產氣反應的試管數目，作為微生物數目的指標，對照課本TableVI,AppendixA，即可得到”最可能數值指數”(mostprobablenumbertestindex;MPNindex)。由於在推斷試驗(Presumptivetest)中出現的陽性反應，也可能是noncoliform微生物所造成，故須將出現陽性反應試管中的微生物取出，作進一步鑑定。所以在確認試驗(Confirmedtest)中，使用eosin-methyleneblue(EMB)agar(伊紅甲烯藍瓊脂)或endoagar作為選擇及鑑別培養基：73Gen.Microbiol.Lab.,2008Dept.Ag

5、ri.Chem.,NTUi.在EMBagar中，其methyleleblue成分可抑制格蘭氏陽性菌的生長。培養後其上之菌落顏色，可區分以下三群：a.Escherichiacoli之菌落具有金屬光澤且中央呈黑色。b.Aerobacteraerogenes之菌落中心呈棕色。c.非乳糖醱酵菌呈粉紅色。ii.endoagar中含有無色態的fuchsin(複紅)，當coliformbacteria在其上生長，並產生酸性產物時，會與fushin反應生成深粉紅色錯合物，因而在其菌落及周圍培養基上呈現出此色來。最後的完成試驗(completedtest)則是將在確認試驗(confirmedtes

6、t)中所確認的coliformcolonies，取出接種至lactosefermentationbroth及NAslant中。在lactosefermentationbroth中可觀察到產氣情形；而在slant培養後長出來的菌落，取出作Gramstain，應可觀察到格蘭氏陰性桿菌，即進一步確定其為E.coli。三、器材：※A：1.culture：池水或飲水機的水50ml滅菌牛奶瓶1個2.medium：LactoseBroth2×(LB2×)3支LactoseBroth1×(LB1×)6支3.equipment：pipetteaid1支10mlpipette1支1mlpipette

7、1支(吸1，0.1ml)B：1.culture：24hrLB(+)2.medium：EMBplate1個Endoplate1個C：1.culture：24hrEMBorEndoplate(+)2.medium：NAslant1支Lactosebroth1支73Gen.Microbiol.Lab.,2008Dept.Agri.Chem.,NTU四、實驗步驟【參考課本Figure.48.1,p.181】A.取樣(Sampling)：1.牛奶瓶口用70%alcohol擦拭一下，取池水或