微量肉汤稀释法药敏检测

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2、素Apramycin95%乙醇水阿奇霉素Azithromycin95%乙醇或冰乙酸肉汤培养基头孢唑啉cefazolin磷酸缓冲液PH6.0,0.1mol/L磷酸缓冲液PH6.0,0.1mol/L...啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊

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4、啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊微量肉汤稀释法药敏检测以下实验方法主要适用于需氧菌及部分兼性厌氧菌（以大肠杆菌为例），微需养菌和厌氧菌的培养条件亟待摸索。本实验方法，虽然操作较为繁琐，但是能够确切的得到细菌临床分离株对某种抗菌药物的MIC值，以此作为临床用药指导的部分依据。菌悬液的制备：①菌液培养：取待测菌保存液10µL加入1mLMH肉汤

5、（可根据实际需要做调整），置37℃温箱过夜静止培养12小时左右；②OD600值测定：利用紫外分光光度仪测定OD值，MH肉汤调整菌液浓度使其OD600值落在0.08-0.1之间，此时菌液浓度约108cfu/mL（大约需将培养菌液稀释7-10倍左右）；③上样菌液稀释：将待测菌液在步骤②所得稀释倍数的基础上再稀释1000倍，此时菌液浓度约105cfu/mL（即7000-10,000倍），此时的菌液即为上样菌悬液；注意：测定OD值所需菌液应在超净台中无菌取样，剩余菌液还需实验。抗菌药物的制备：抗生素母液配制：参照NCCL

6、S标准上抗菌药物相应的R（抗药）值制备待测抗菌药物（母液浓度要远远大于R值，至少160倍），分装于无菌小管置-20℃备用（附件一.常用抗生素溶液的配制）。注意：无菌操作，抗菌药物的稀释液均需灭菌，溶解后还应过滤（滤膜孔径为0.22µm）药敏试验的操作：①将待测抗菌药物进行10倍稀释；②无菌96孔板第1-11列加入灭菌MH肉汤100µL（一药一板）；③无菌96孔板第1列加入10倍稀释的药液100µL，逐次倍比稀释至第11列（每孔液体终体积是100µL）；④无菌96孔板的每一孔加入待测菌液100µL，每孔液体终体积是

7、200µL（由于整板都是一种药物，所以96孔板的每一行可进行一种细菌的药敏试验，为了保证实验的可靠性，每株菌进行一次重复，即一株菌做两行，一块板可做四株细菌的药敏试验）；⑤无菌96孔板的第12列上4孔加入200µL/孔灭菌MH肉汤作为阴性对照，第12列下4孔加入200µL/孔菌液（四株菌的菌液）作为阳性对照；⑥药物和菌液上样完毕后，盖好板盖，置37℃温箱培养18-22小时观察结果（结果的判读请参照附件二.2009年NCCLS抗菌药物敏感性试验解释标准）。注意：无菌操作。96点阵法药敏检测（大通量的药物敏感性检测实

8、验）以下实验方法主要适用于需氧菌及部分兼性厌氧菌（以大肠杆菌为例），微需养菌和厌氧菌的培养条件亟待摸索。该方法能够快速得到某种抗菌药物对细菌临床分离株的作用，抗药还是敏感，以此作为临床用药指导的部分依据。菌悬液的制备：①菌液培养：无菌96孔板培养96株待测菌株（每一孔对应一株菌），每孔含有灭菌MH肉汤200µL，待测菌株保存液5µL，置37℃温箱过夜静止培养12小时左右；