hcul4a过表达对缺氧缺血-再供氧再灌注损伤的保护作用及机制初探

《hcul4a过表达对缺氧缺血-再供氧再灌注损伤的保护作用及机制初探》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、分类号VDC博士学位论文密级hCUL4A过表达对缺氧／缺血一再供氧／再灌注损伤的保护作用及机制初探TheprotectiveeffectandmechanismofhumanCUL4Aoverexpressiononl⋯l■·●●』■●aypoxia／ischemia-reoxygenatton／relDerlUstonlnlnrV作者姓名：谭灿学科专业：人体解剖与组织胚胎学学院(系、所)：基础医学院指导教师：张建湘教授论文答辩日期丝!三：一J7答辩委员会主中南大学二。一二年五月原创性声明lII

2、IIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIllllllllllllllIY2197905本人声明，所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了论文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中南大学或其他单位的学位或证书而使用过的材料。与我共同工作的同志对本研究所作的贡献均已在论文中作了明确的说明。作者签名：日期：业年1月』日学位论文版权使用授权书本人了解中南大学有关保留、使用学位论文的规定，即：

3、学校有权保留学位论文并根据国家或湖南省有关部门规定送交学位论文，允许学位论文被查阅和借阅；学校可以公布学位论文的全部或部分内容，可以采用复印、缩印或其它手段保存学位论文。同时授权中国科学技术信息研究所将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》，并通过网络向社会公众提供信息服务。一作者签名：导师签名日期：丝!!年』／月丛日博士学位论文摘要缺氧／缺血性损伤广泛存在于包括癌症、中风以及神经退行性疾病等多种疾病中，再供氧／再灌注会导致DNA损伤的积累从而加重缺氧／缺血造成的损伤。缺氧／缺血一再供氧／再

4、灌注会导致非正常折叠或受损蛋白的积聚，这些蛋白大多被泛素一蛋白酶体系统清除。泛素介导的蛋白降解作用由底物蛋白的泛素化以及26S蛋白酶体参与的蛋白降解构成。泛素化包括了分别由E1激活酶、E2结合酶及E3连接酶催化的泛素激活、耦联以及转移三个级联步骤。其中，E3连接酶决定了泛素化修饰的底物专一性。以cullin环为基础的E3是E3酶中最大的家族之一，Cullin4A(CUL4A)是该家族的核心成员之一。CUL4A通过参与p53、p27和Cdtl等相关蛋白的降解过程，在肿瘤抑制、细胞成活、DNA损伤响

5、应、细胞增殖以及基因组稳定性的维持等方面发挥了重要的作用。尽管有证据暗示表达上调的Cul4A有可能参与到细胞对缺氧／缺血一再供氧／再灌注导致的损伤的响应中，但是CUL4A在这一过程中的具体作用仍不得而知。在本研究中，我们构建了人源CUL4A(humanCUL4A，hCUL4A)的腺病毒表达载体，通过病毒转染将hCUL4A成功导入了PCI2细胞以及大鼠脑中。在随后的研究中，我们对CUL4A在缺氧／缺血一再供氧／再灌注导致的损伤中的功能及其作用机制作了初步探索。一、缺氧一再供氧诱导PCI2细胞Cul

6、4A基因表达目的：检钡1]VCl2细胞中内源Cul4A基因对缺氧一再供氧(hypoxia．reoxygenation，H／R)处理的响应。方法：我们首先根据前人研究中的描述，建立PCI2细胞H瓜体系。通过检测缺氧后培养液氧分压(partialpressureofoxygen，p02)的变化及细胞缺氧后缺氧诱导因子la(hypoxia．induciblefactor-1alpha，HIF—la)蛋白的表达确认缺氧体系的有效性。然后，在PCI2细胞缺本课题受如下资金资助：中南大学研究生创新教育工程(

7、项目编号：2340—77211和CX2010839)博士学位论文摘要氧1．5h，分别再供氧0．5、1、2、3、4矛1]8h提取细胞总砌妊进行半定量RT—PCR坳,4内源Cul4A表达。结果：缺氧后无细胞培养液@p02升高，PCI2细胞缺氧3h后细胞内HIF一1ct蛋白表达升高。半定量RT-PCR的结果显示，PCI2细胞中内源Cul4A在H／R处理1~4h2_内被诱导至正常水平的三倍左右，随后在8h时下降到接近正常水平。结论：细胞缺氧系统是有效、稳定可靠的。PCI2细胞内源Cul4A基因受H／R诱

8、导上调表达，Cul4A可能会参与至fJPCI2细胞对H／R损伤的细胞响应中。二、人CUL4A重组腺病毒载体的构建及其在PCI2细胞中的表达特点目的：为研究CUL4A的表达上调在PCI2细胞删R损伤中的作用，我们需要首先构建携带有绿色荧光蛋白(greenfluorescenceprotein，GFP)报告基因及hCUL4A基因的腺病毒表达载体，并研究其在PCI2细胞中的表达特点。方法：扩增hCUL4A基因，并通过In．FusionPCR克隆技术构建穿梭质粒pDC315．hCUL4A．EGFP，利用