五种病害相关植原体的分子鉴定

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1、山东农业大学硕士学位论文五种病害相关植原体的分子鉴定姓名：常文程申请学位级别：硕士专业：植物病理学指导教师：李向东20120612IJJ尔农qk人‘学fljj!I一学化论义中文摘要本论文利J日分子生物学手段对棣棠丛枝病、凤仙花绿瓣病、迎春丛枝病、黄刺梅丛枝病、小叶女贞从枝病病原进行分子检测与鉴定。用植原体16SrRNA犟凶和，∥基冈通用引物，对表现丛枝症状的棣棠DNA进行巢式PCR扩增，分别得到了约1．2kb和800bp的特异性片段。序列分析表明：与棣棠丛枝相关植原体(KWB)的16SrRNA基因和tuf基因均与翠菊黄化植原

2、体组(16SrI)D亚纠【泡{1

3、4丛枝株系一敛牢最高，为99．40／．平u99．6％。在系统进化树中，KWB也与16Srl．D亚组分离物聚类剑⋯起。利『1j虚拟RFLP分析发现，KWB的16SrRNA基因Alul、Hhal、MseI、TaqI限制’H-．酶切陶谱与16Srl．D亚组植原体一致。以上结果表明，与棣棠丛枝病相关的植原体属于16Srl．D亚组。利用械原体16SrRNA和核糖体蛋白基因(rp)通用引物从表现绿瓣症状的凤仙花DNA中分别扩增得到了约1．24kb和1．21kb的特异性片段。序列测定和分析的结果表明，’J

4、风仙花绿瓣痫(Balsaminevirescence，BV)相关植原体的16SrRNA基因和印基因均与翠菊黄化植原体组(16Srl)泡桐丛枝株系(16SrI—D亚组)一致率最高，为99．7％。在系统进化树中，BV也与16Srl．D亚组分离物聚类到一起。利用虚拟RFLP分析发现，BV限制性酶切罔谱与16Srl．D亚组植原体一致。本研究首次从分子水平上证明与风仙仡绿瓣病年u火的卡Il【原体属j：16Srl．D亚组。对表现从枝症状的迎春枝条的韧皮部进行超薄切片及电镜观察，发现大量典型植原体。通过对16SrRNA基闪和rp丛晖l序列

5、分析发现，与迎春丛枝相关植原体(JNWB)的16SrRNA基【划和rp毖12_i均与翠菊黄化植原体组(16SrI)D亚组泡桐丛枝株系一致牢最高，为99．6％和99．7％。在系统进化树中，JNWB也与16Srl．D亚组分离物聚类到一起。利川J船拟RFLP分析发现，JNWB的16SrRNA毖因17种限制性酶切图谱与16SrI．D业组植原体‘敛。以上结果农明，JNWB属于16SrI．D亚组。与迎春丛枝病桐关的植原体属于16SrI．D业组。以友脱从枝癌状的黄刺梅枝条总DNA为模板进行巢式PCR扩增，得到了约1．24kb的16SrRN

6、AJ-饕1人l”段、800bp的，∥’J。#闪片段和1．21kb的伊基因片段，将此植原体命名为黄刺梅从枝{：II【历i体(Rosaxanthinawiches'-broomphytoplasma，RXWB)。对获得的序列与NCBI数抛库t{，相天干lIf原体序列进行一致牢分析，发现与翠菊黄化组(16Srl组)植瞒i体⋯敛牢较l{!五，其中与16SrI．D组的一致率分别i岛达99．8％、99．9％、99．8％。在系五种粕击棚关植蟓休的分了攀定统进化树l{‘J．RXWB与16SrI—D弧组巾的植原体聚为一簇。利用iphyClas

7、sifier在线软件模拟RFLP分析，发现RXWB与16SrI．D亚组FJ263621的酶切图谱一致。所有证据表明RXWB属于16Srl．D哑组。从表现从枝等症状的小叶女贞的总DNA中，克隆了其16SrRNA基因、tuy基因，与16Srl．DfltJF列的一4致率分别高达99．8％和99．7％。系统进化分析中，PPWB与16SrI．D亚组中的植原体聚为一簇。基于16SrRNA摹因的模拟RFLP分析也表明PPWB与l6Srl．D丑眨组卡II(原体酶切图嘴一一致。结果证明，自然表现丛枝症状的小叶女贞枝条中存在16Srl．D弧组的

8、植原体。关键词：植原体；16SrRNA基因；tuf基因；rp基因；系统进化分析；RFLP2MolccularIdcntincationofFiveDiseasesAssociatedwithPhytoplasmasAbstractInthisstudy，phytoplasmasassociatedwithKerriawitches’broom，Balsaminevirescence，dasminumnudi／lorumwitches'-broom，Rosaxanthinawitches'-broom．PurpuSprivet

9、witches’broomweredetectedandidentifiedusingatmolecularlevel．Byusinguniversalprimersforphytoplasmal16SrRNAandtufgenes，twospecificfragmentsofCa．1．2