实验动物的组织处理

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1、肝脏好比人体化工厂，人体各种营养物质的转化合成都由肝脏完成，各种各样的毒素亦要经过肝脏来排解。少量喝酒，经过肝脏解毒代谢后，变成无毒的物质排出体外；若长期大量饮酒，酒精的代谢产物乙醛对肝细胞的毒性作用就非常人。在多数情况下，人们并不知道自己患上了酒精性法病，等到出现症状以后，如肝区疼痛、全身无力、消化不良、食欲不振、恶心呕吐、腹胀腹泻等症状，到医院检查发现肝功能异常，如转氨酶升高，这已是酒精性肝炎。此时若不及时治疗或继续喝酒，很容易发展成为酒精性肝纤维化和酒精性肝硬化，继而还会出现腹水、消化道大出血等

2、，重者有生命危险。酒精肝症状表现：轻症会出现腹胀、乏力、肝区不适、厌食，还有黄疸、肝肿大和压痛、面色灰暗、腹水、浮肿、蜘蛛痣、发热、白细胞增多（主要因此是中性粒细胞增多）类似细菌性感染，少数有脾脏肿大等症状，血清胆红素＜100iimol/L；中重度除上述症状外，有持续低热、腹泻、四肢麻木、手颤、性功能减退、男性有勃起功能障碍等，肝功能检查有AST和ALT中度升高、AST/ALT比值接近3等指标。酒精肝病理变化：从整体酒精性肝病的发病而言，酒精肝只是酒精性肝病早期出现的一种疾病，或者说属于酒精性肝病的一

3、个病理阶段，若继续发展会发牛肝细胞的炎症，以及肝脏纤维化，肝细胞坏死等病理变化。这主要与酒精（乙醇和乙醛）对肝脏的直接毒理作用，以及伴有的营养不良等因素有关。乙醛（高活性化合物）干扰肝细胞功能，损害微管，使蛋白、脂肪排泌障碍而在肝细胞内蓄积，乙醇、乙醛被氧化时，产生还原型辅酶I,阻碍肝脏释放蛋白质，抑制糖原异生作用，阻碍维生素的利用，促使和导致脂肪肝的形成；乙醇可阻碍硫胺等向活性型转变或阻碍其利用，最终加速导致肝细胞的脂肪浸润、炎症、坏死。而口酒精引起的高乳酸血症，通过刺激脯氨酸疑化酶的活性和抑制脯氨

4、酸的氧化，可使脯氨酸增加，从而使肝内胶原形成增加，一些炎性细胞因子和乙醇、乙醛的毒性作用可使肝星状细胞、肝细胞、枯否细胞活化，分泌一些细胞外基质，加速和促使肝硬化1.实验动物的组织处理取组织块5g,置于组织匀浆器中，加入冰浴冷却的生理盐水或者0.lmol/L磷酸缓冲液（PH7.4）5niL研磨成50%的组织匀浆液，迅速放入冷冻离心机，5000r/min离心15min,取上清液，分装，-4°C冷冻后待用，其余的组织亦置于-4°C冷冻保存。2.组织匀浆液的蛋白质含量的测定2.1实验原理蛋白质含量的测定采用

5、Bradford测定法。该方法基于考马斯亮蓝G-250能与蛋白质通过范得华相互作用形成蛋白质—考马斯亮蓝复合物蓝色溶液，在595nni处有最大吸收值。蛋口质-考马斯亮蓝复合物溶液颜色的深浅与蛋白质的浓度成止比。2.2试剂配制（1）蛋白质标准溶液：精确称取lOOrng牛血清白蛋片，加双蒸水溶解并定容到100mL,溶液即为1000ug/mL牛血清白蛋白溶液。(2)考马斯亮蓝G-250蛋白试剂：称取1OOmg考马斯亮蓝G-250溶于50mL90%乙醇溶液中，加入85%的磷酸lOOmL,充分混匀，用双蒸水定容

6、至lOOOmL,混匀后即成。2.3实验方法(1)0-1000ug/mL标准曲线的制作①取6支试管，按表2进行配制。②進确吸取所配制各管溶液0.05mL,分别放入lOmL具塞试管屮，再加入2.5mL考马斯亮蓝G-250蛋白试剂，盖塞，将试管中溶液纵向倒转混合，放置2min。③用光径为10mm的比色杯在595nm下比色，以吸光值为纵坐标，牛血清白蛋白浓度为横坐标绘制蛋白标准曲线。表1蛋白质标准曲线的配制试管编号试剂(mL)123456牛血清白蛋白溶液(1000ug/mL)0.00.20.40.60.81.

7、0双蒸水1.00.80.60.40.20.00D595nm0.0000.2280.3750.5020.7040.845(2)样品溶液蛋白含量测定(要稀释，50%的组织液要稀释50倍)吸取样品溶液0.05mL放入具塞试管中，加入2.5mL考马斯亮蓝G-250蛋白试剂，充分混合，放置2min后用光径为10mm的比色杯在595nm下比色测定吸光值01民湎，对照标准曲线即可求出样品溶液屮蛋口质的浓度(Ug/mL),通过进一步的计算即可得岀样品溶液蛋白质总含量血)。样品溶液中蛋白含量(mg)=1381.9X0D

8、•海口(mg/mL)X样品溶液体积(mL)X稀释倍1000数3•小鼠肾组织谷丙转氨酶(ALT)含量测定2.1实验原理ALT作用于由丙氨酸及a-酮戊二酸组成的基质，在一定的反应条件下，产牛一定量的丙酮酸。在酶反应到规定时间时，加入2,4-二硝基苯月井，在当量浓度的酸性条件下，终止了酶反应。2,4-二硝基苯脐分别与反应产生的丙酮酸及剩余的基质a-酮戊二酸形成各自对应的2,4-二硝基苯腺。在碱性条件下，虽然二种苯腺分别显岀红棕色，但由于丙酮酸生成的颜色较深，以