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时间:2019-02-19
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1、肝脏好比人体化工厂,人体各种营养物质的转化合成都由肝脏完成,各种各样的毒素亦要经过肝脏来排解。少量喝酒,经过肝脏解毒代谢后,变成无毒的物质排出体外;若长期大量饮酒,酒精的代谢产物乙醛对肝细胞的毒性作用就非常人。在多数情况下,人们并不知道自己患上了酒精性法病,等到出现症状以后,如肝区疼痛、全身无力、消化不良、食欲不振、恶心呕吐、腹胀腹泻等症状,到医院检查发现肝功能异常,如转氨酶升高,这已是酒精性肝炎。此时若不及时治疗或继续喝酒,很容易发展成为酒精性肝纤维化和酒精性肝硬化,继而还会出现腹水、消化道大出血等
2、,重者有生命危险。酒精肝症状表现:轻症会出现腹胀、乏力、肝区不适、厌食,还有黄疸、肝肿大和压痛、面色灰暗、腹水、浮肿、蜘蛛痣、发热、白细胞增多(主要因此是中性粒细胞增多)类似细菌性感染,少数有脾脏肿大等症状,血清胆红素<100iimol/L;中重度除上述症状外,有持续低热、腹泻、四肢麻木、手颤、性功能减退、男性有勃起功能障碍等,肝功能检查有AST和ALT中度升高、AST/ALT比值接近3等指标。酒精肝病理变化:从整体酒精性肝病的发病而言,酒精肝只是酒精性肝病早期出现的一种疾病,或者说属于酒精性肝病的一
3、个病理阶段,若继续发展会发牛肝细胞的炎症,以及肝脏纤维化,肝细胞坏死等病理变化。这主要与酒精(乙醇和乙醛)对肝脏的直接毒理作用,以及伴有的营养不良等因素有关。乙醛(高活性化合物)干扰肝细胞功能,损害微管,使蛋白、脂肪排泌障碍而在肝细胞内蓄积,乙醇、乙醛被氧化时,产生还原型辅酶I,阻碍肝脏释放蛋白质,抑制糖原异生作用,阻碍维生素的利用,促使和导致脂肪肝的形成;乙醇可阻碍硫胺等向活性型转变或阻碍其利用,最终加速导致肝细胞的脂肪浸润、炎症、坏死。而口酒精引起的高乳酸血症,通过刺激脯氨酸疑化酶的活性和抑制脯氨
4、酸的氧化,可使脯氨酸增加,从而使肝内胶原形成增加,一些炎性细胞因子和乙醇、乙醛的毒性作用可使肝星状细胞、肝细胞、枯否细胞活化,分泌一些细胞外基质,加速和促使肝硬化1.实验动物的组织处理取组织块5g,置于组织匀浆器中,加入冰浴冷却的生理盐水或者0.lmol/L磷酸缓冲液(PH7.4)5niL研磨成50%的组织匀浆液,迅速放入冷冻离心机,5000r/min离心15min,取上清液,分装,-4°C冷冻后待用,其余的组织亦置于-4°C冷冻保存。2.组织匀浆液的蛋白质含量的测定2.1实验原理蛋白质含量的测定采用
5、Bradford测定法。该方法基于考马斯亮蓝G-250能与蛋白质通过范得华相互作用形成蛋白质—考马斯亮蓝复合物蓝色溶液,在595nni处有最大吸收值。蛋口质-考马斯亮蓝复合物溶液颜色的深浅与蛋白质的浓度成止比。2.2试剂配制(1)蛋白质标准溶液:精确称取lOOrng牛血清白蛋片,加双蒸水溶解并定容到100mL,溶液即为1000ug/mL牛血清白蛋白溶液。(2)考马斯亮蓝G-250蛋白试剂:称取1OOmg考马斯亮蓝G-250溶于50mL90%乙醇溶液中,加入85%的磷酸lOOmL,充分混匀,用双蒸水定容
6、至lOOOmL,混匀后即成。2.3实验方法(1)0-1000ug/mL标准曲线的制作①取6支试管,按表2进行配制。②進确吸取所配制各管溶液0.05mL,分别放入lOmL具塞试管屮,再加入2.5mL考马斯亮蓝G-250蛋白试剂,盖塞,将试管中溶液纵向倒转混合,放置2min。③用光径为10mm的比色杯在595nm下比色,以吸光值为纵坐标,牛血清白蛋白浓度为横坐标绘制蛋白标准曲线。表1蛋白质标准曲线的配制试管编号试剂(mL)123456牛血清白蛋白溶液(1000ug/mL)0.00.20.40.60.81.
7、0双蒸水1.00.80.60.40.20.00D595nm0.0000.2280.3750.5020.7040.845(2)样品溶液蛋白含量测定(要稀释,50%的组织液要稀释50倍)吸取样品溶液0.05mL放入具塞试管中,加入2.5mL考马斯亮蓝G-250蛋白试剂,充分混合,放置2min后用光径为10mm的比色杯在595nm下比色测定吸光值01民湎,对照标准曲线即可求出样品溶液屮蛋口质的浓度(Ug/mL),通过进一步的计算即可得岀样品溶液蛋白质总含量血)。样品溶液中蛋白含量(mg)=1381.9X0D
8、•海口(mg/mL)X样品溶液体积(mL)X稀释倍1000数3•小鼠肾组织谷丙转氨酶(ALT)含量测定2.1实验原理ALT作用于由丙氨酸及a-酮戊二酸组成的基质,在一定的反应条件下,产牛一定量的丙酮酸。在酶反应到规定时间时,加入2,4-二硝基苯月井,在当量浓度的酸性条件下,终止了酶反应。2,4-二硝基苯脐分别与反应产生的丙酮酸及剩余的基质a-酮戊二酸形成各自对应的2,4-二硝基苯腺。在碱性条件下,虽然二种苯腺分别显岀红棕色,但由于丙酮酸生成的颜色较深,以
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