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1、春季保护地小型西瓜苗期枯萎病与叶枯病初步鉴定摘要：随着春保护地西瓜种植面积的扩大和工厂化育苗的发展，西瓜苗期病害也越来越严重，有些常见于生长期的病害，现在在苗期也有较重发生。对湖北省宜城市流水镇育苗场采集的2份西瓜苗期病样，进行分离、纯化并回接病原菌，然后利用PCR扩增真菌保守的ITS序列，初步确定所采集病样1-a的致病菌为枯萎病病原菌[FusariumoxysporumSchl.f.sp.niveum(E.F.Smith)SnyberetHansen],病样1-b的致病菌为叶枯病病原菌[Alternariacucumerina(Ell.etEv.)Elliott]o本研究
2、利用分子鉴定手段，避免了传统分类方法的繁琐、耗时和结果不稳定性等缺点。关键词：西瓜；枯萎病；叶枯病；苗期病害中图分类号：S436；S651文献标识码：A文章编号：1001-3547(2013)16-0068-03早春保护地西瓜上市早，价格高，经济效益好，近年来在湖北发展较快，其对西甜瓜嫁接苗的巨大市场需求促进了工厂化育苗的快速发展。但由于部分小型育苗场设施简陋，环境调控能力差，加上不注重种子处理，苗期频发多种病害。2012年3〜4月，湖北省低温阴雨持续时间长，宜城市小型苗场发病较重。湖北省农业科学院经济作物研究所对其中发生较为普遍的2种病害进行了分离、鉴定，以期对其防治起到
3、指导作用。1材料与方法1.1供试菌株从湖北宜城市流水镇育苗场西瓜苗上采集病样，图l-a病样的病部有粉红色霉状物，图1-b病样的病部呈水渍状，用组织分离法［1］分离病原菌，然后纯化、保存。1.2致病性测定根据柯赫氏法则［2］进行寄主活体接种，接种菌丝，以清水为空白对照，3次重复。出现田间相同的症状时再次分离，并将2次获得的分离菌作比较，以确定该菌病原菌。1.3DNA提取将病原菌菌块移至马铃薯蔗糖培养基(PSA)平板上，25£黑暗条件下培养48〜72h,然后将菌落边缘的菌丝切成2〜3mm的菌落小块，把4〜5块菌丝移至PSA液体培养基，28°C.180r/min振荡培养2d。将液
4、体培养好的病菌菌丝,在双层尼龙网上过滤，用水洗涤2次，以除去菌丝内的培养液，收集菌丝，将其包好放在硅胶中过夜，吸干水分，用液氮研磨成粉末，参照Knapp等［3］报道的CTAB(Cetyltrim-ethylammoniumbromide)法提取病菌菌丝DNAo①PCR引物病原菌rDNA的ITS区域PCR扩增选用的引物分别为ITS-F和ITS-R,其碱基序列如下［4］：ITS-F(5‘-GTCCTAACAAGGTTTCCGTA-3'),ITS-R(5'-TTCTCCGCTTATTGATATGC-3')。①PCR混合物10mmol/L三磷酸碱基脱氧核昔酸0.6uL,20mmol
5、/L氯化镁1.2uL,缓冲液2.0nL,加10umol/L引物ITS-F和ITS-R各1.0uL,2U/uLTaq酶1.0uL,模板1.0nL,使用超纯水将反应体系补至20nLo②PCR反应热循环参数设置为94工预变性4min；94°C30s,56°C退火30s,72°C延伸90s,循环36次；72°C延伸6minoPCR产物以1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，检测到600bp左右的条带，将病原菌基因组PCR扩增产物回收，回收片段与克隆载体进行pGEM-T连接，然后转化至大肠杆菌DH-5a感受态细胞，进行蓝白斑筛选，选取阳性菌落扩大培养后，部分菌液用M13进行PCR扩增，凝胶电泳检测
6、，并将检测后确认含有目的片段的阳性克隆送到华大基因测序公司测序，将测序结果提交GenBank进行分析。根据序列分析和形态学鉴定的结果，对所分离的病原菌进行鉴定。2结果与分析1.1病原菌回接鉴定菌丝接种第5天病部有粉红色霉状物(图2-a)和水渍状(图2-b),与田间症状相同。从回接表现症状的病叶中再次分离到病原菌。2.2病原菌的rDNA-ITS序列验证用病原菌rDNA的ITS区域进行扩增，均扩增出约600bp的特异性片段(图3)。测序后通过GenBank软件比对序列：病样1-a分离获得的菌株1〜2的rDNAITS序列与Fusariumoxysporum的相似度达99%,而西瓜
7、枯萎病的致病菌是尖胞镰刀菌西瓜专化型(F.oxysporumSchl.f.sp.niveum(E.F.Smith)SnyberetHansen),初步判断所得病菌为西瓜枯萎病致病菌［5］。病样1-b分离获得的菌株3〜4的rDNAITS序列与半知菌交链胞霉属(Alternariasp.)的序列相似度高达99%,西瓜叶枯病的致病菌是瓜链格胞菌(A.cucumerin),初步判断所得病菌为西瓜叶枯病致病菌［6］。3小结与讨论西瓜枯萎病和叶枯病均可全生育期发病，且以中后期发病为主，传播途径以土壤和病残体带菌为主，种子也可携
