细胞吞噬和酸性磷酸酶染色

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1、报告成绩实时记录成绩实验三细胞吞噬和酸性磷酸酶染色（Gomori氏法）学生姓名学号班级座位号：同组同学日期：2014年10月21日备注：【Introduction】（1）细胞吞噬在生命活动中的作用和意义：吞噬细胞可以抵御外来物质的入侵，也能发挥特异性免疫的作用。单细胞动物通过细胞吞噬作用摄取营养物质；高等动物通过巨噬细胞的吞噬作用防御微生物的侵入，消除衰老和死亡的细胞。（2）溶酶体的概念和生理作用：溶酶体是普遍存在于所有动物细胞（哺乳动物的成熟红细胞除外）中的细胞器。主要功能有：消化营养保护作用、对细胞内吞物质的消化、对细胞自身物质的消化、参与机

2、体组织器官的变态和退化、参与受精作用、参与激素的合成和浓度调节。（3）酶细胞化学实验技术的原理及其实验注意点：酶细胞化学是利用细胞内酶具有催化某种反应的特性来检测酶活性。在一定条件下酶进行催化产生可见的沉淀物，最后被光镜或电镜识别，以此来研究酶的定位及活性变化。在实验时，要注意实验的温度、pH值、固定剂、抑制剂或激活剂、底物浓度、作用时间、避免扩散，使细胞的形态结构保存良好，并保持酶的活性。【Materials&methods】实验仪器：复式双筒显微镜（带油镜）；Motic数码互动系统；擦镜纸/盖玻片；载玻片/镊子；记号笔；小片滤纸；移液器/吸头

3、；香柏油/二甲苯；高速离心机2台；温箱1台（30℃）；水浴锅2台（37℃）；烘箱1台（100℃）。实验材料：四膜虫培养液（500μl）；0.1%油烟墨汁（500μl）；2%豆奶液（200μl）。实验试剂：10%甲醛溶液；酸性磷酸酶作用液；0.2%硫化铵水溶液（现用现配）；蒸馏水；亮绿。实验操作：1．ACP染色：（1）吞噬：吸取200μl四膜虫培养液加入豆奶中→离心→快速弃去上清液。（2）制片：吸取10μl悬浮液滴在载玻片上→设置对照组→干燥→在甲醛中固定→蒸馏水浸洗。（3）反应：空白对照在100度烤箱中干烤→所有标本放入酶作用液→实验组37度水浴

4、10分钟，对照组采用其他温度→反应完毕在自来水中浸泡。（4）显色：放入0.2%(NH4)2S中，实验组显色60秒，对照组采用其他时间→反应完毕在自来水中浸泡→彻底干燥后40倍镜检。4/42．四膜虫吞碳：（1）吸取10μl四膜虫培养液于载玻片上→10倍镜观察→加入20μl墨汁→混匀→10倍镜观察（2）涂布开→干燥→亮绿染色20秒→自来水中浸洗1分钟→干燥后40倍镜观察【Results】1．ACP染色：40倍物镜下，可观察到实验组的四膜虫细胞内有许多深棕色的小泡。生物绘图请见附录。2．四膜虫吞碳：10倍镜下，可观察到四膜虫不停游动，吞噬碳粒。亮绿处理

5、后，在40倍物镜下可观察到四膜虫细胞中有大小不同的黑色碳粒。【Discussion】1.讨论实验为何出现所得结果。若实验结果不理想，请分析是何原因？如何改进？答：由下表一分析可得，硫化铵显色的时间不能太久，最好控制在30秒左右，否则颜色过深。另外，酶作用的时间如果太长，可能引起产物的扩散，使颜色过深；酶作用的温度太低，也会对结果产生一定的影响，使颜色过浅。序号结果分析1空白对照温度（37℃）硫化铵（30s）细胞呈淡黄褐色，无吞噬泡形成的迹象100℃烤了10分钟，酸性磷酸酶变性失去活性，不能分解β-甘油磷酸磷生成磷酸盐沉淀2温度（37℃）硫化铵（3

6、0s）可见四膜虫细胞内有许多深棕色的小泡此反应条件下观察较恰当，小泡就是吞噬溶酶体，酸性磷酸酶所在的位置3温度（37℃）硫化铵（60s）四膜虫内有一些深棕色小泡，中间还有深棕色团块此温度下显色太过，有吞噬溶酶体，但是产物已经扩散5温度（4℃）硫化铵（30s）四膜虫内有一些浅色小泡，此温度下显色不够，有吞噬溶酶体，但是不明显6温度（4℃）硫化铵（60s）四膜虫内有一些深棕色小泡，中间还有深棕色团块此温度下显色太过，有吞噬溶酶体，但是产物已经扩散表一当酶作用时间10分钟时，不同条件处理后的四膜虫2.对该实验有何意见或建议？答：整个实验流程还是比较紧凑

7、有序的，只是在酶作用的时间上最好做一下调整。因为从实验结果来看，原先安排的20分钟太长了，可能会导致酶产物扩散，我认为10分钟是比较合适的。另外，对照组的显色时间最好再安排一个梯度，比如45秒。【Questions】4/41.如果标本在工作液中孵育时间过久，可能会出现什么现象？答：如果标本在酸性磷酸酶作用液中孵育过久，可能会造成酶和产物扩散以及核染色现象，镜检时就会出现较大的棕黑色团状，影响观察效果。2.实验结果中观察到是深色物质就一定是酸性磷酸酶吗？答：不一定。因为空白对照组中也能观察到四膜虫细胞呈淡黄褐色，说明细胞中有酸性磷酸酶之外能显色的物

8、质。理论上来说，只要有磷酸基团的存在，就能与铅离子结合生成无色的磷酸盐沉淀，磷酸盐再与硫化铵作用，生成棕黑色的硫化铅沉淀，从而显示出深色