马铃薯晚疫病抗性相关胞质类受体蛋白激酶基因stpk1的功能研究

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1、华中农业大学硕士学位论文马铃薯晚疫病抗性相关胞质类受体蛋白激酶基因StPK1的功能研究姓名：王敏申请学位级别：硕士专业：蔬菜学指导教师：谢从华201206马铃薯晚疫病抗性相关胞质类受体蛋白激酶基因StPKl的功能初探摘要晚疫病是马铃薯生产中最具毁灭性的病害。晚疫病抗性分为垂直抗性和水平抗性，垂直抗性由主效基因控制，具有小种转化性，抗性常因晚疫病菌生理小种变异而迅速丧失。水平抗性是由微效多基因控制的，对马铃薯晚疫病具有广谱性，稳定性的特点。因此，选育广谱，稳定的水平抗性品种己成为马铃薯晚疫病抗病育种的重要目标。本实验室前期从马铃

2、薯晚疫病水平抗性相关的ESTs中克隆出一个可以调控马铃薯晚疫病抗性的胞质类受体激酶基因StPKl。植物激酶是一类重要的蛋白激酶，它们在抗病性，抗逆和生长发育等方面都具有重要作用。前期研究表明，StPKI基因可被马铃薯晚疫病诱导表达，但其功能有待进一步试验证实。同时，StPKI蛋白是否具有激酶活性亦为探讨该基因的作用机理所必须。本课题通过基因StPKl转基因株系的抗病性鉴定、蛋白激酶原核表达及激酶活性测定等研究，探讨基因StPKI在抗晚疫病中的作用机理。主要结果如下：1．利用Realtime．PCR筛选已获得的&肷J超量转基因株

3、系和干涉转基因株系，其中StPKl干涉株系干涉效率最高为70％，超量表达株系表达量最高为对照E3的600倍。后续晚疫病抗性鉴定选用了以上5株超量表达和4株干涉表达效果好的转基因株系进行晚疫病接种实验。统计病斑面积结果，超量表达株系病斑扩展速率显著小于对照(E3)病斑扩展速率，干涉株系的病斑扩展速率显著大于对照(E3)病斑扩展速率，表明StPKl基因参与了马铃薯晚疫病抗病性反应。2．构建了StPKl的绿色荧光表达载体GFP-StPKl，转化大肠杆菌，抽提质粒后，用基因枪轰击法转化洋葱表皮细胞，暗培养12小时后，激光共聚焦显微镜观

4、察。发现，GFP-StPKl绿色荧光主要出现在细胞质中，说明蛋白激酶StPKl是在马铃薯细胞质内行使功能。3．构建了StPKl基因的原核表达载体，转化大肠杆菌，用IPTG诱导融合蛋白体外表达。GST柱式透析纯化蛋白质，用同位素标记的7_32p．ATP测定蛋白激酶的磷酸化活性。结果表明，蛋白激酶StPKI与ATP发生反应，有较强的自磷酸化活性，是一个有活性的蛋白激酶。蛋白激酶StPKl磷酸化活性的证实，为寻找其磷酸化互做底物及深入探讨其抗病性的作用机理奠定基础。关键词：晚疫病，马铃薯，蛋白激酶，StPKI，RLCK，抗病性华中农

5、业大学2012届硕士研究生学位论文AbstractLateblight，themostdevastatingdiseaseofpotatoproduction，isdividedintoverticalresistallceandhorizontalresistance．Theformeriscontrolledbydominantresistance僻)genesandhaveracespecialty,whichcanbeeasilyovercomedbytherapidevolutionofnewvirulentrace

6、sofPinfestans．andthelateriscontrolledbymanyinteractinggenesandexpectedtobemoredurableandreliable．Therefore，selectingthehorizontalresistancevariety"againStlateblighthasbecomethepivotalaimonpotatobreeding·StPKl，acytoplasmicreceptor-likekinase，wasclonedfromthehorizonta

7、lresistancevarietyofpotatoaganistlateblightbythepreviousworkinOurlab．Itmayhavesomeimportantfunctioninthesingaltransductionoflateblightresistance．PlantproteinkinaseiSoneofthemostimportantkinaseswhichplayaveryimportantroleindiseaseresistanceandstresstoleranceaswellasp

8、lantgrowth．Thepreliminaryexperimentsshowthat，theStPKlcanbeinducedbyPinfestans，butthefunctionremainstobeidentifiedwithfurtherexperiments．At