耐酸天才真菌次生代谢产物的研究及酸调作用初探

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1、中国海洋大学博士学位论文耐酸天才真菌次生代谢产物的研究及酸调作用初探姓名：王慧申请学位级别：博士专业：药物化学指导教师：朱伟明201206耐酸天才真菌次生代谢产物的研究及酸调作用初探搁要耐酸微生物是可以生存在低pH环境中的极端微生物，由于其生存环境的特殊性，其次生代谢产物中可能存在结构新颖且具有生物活性的化学成分。目前国际上对于耐酸微生物次生代谢产物研究报道较少，该项研究工作前景诱人。“天才菌株”是指那些次生代谢产量较大，并且能够产生系列新结构的生物活性菌株。从酸性环境获得耐酸天才菌株，相信有望寻找到生物活性物质。本文对采自酸性地质环境的云南建水紫陶土壤和锰矿土壤以及河南云

2、台山国家地质公园泥土共27个样品中分离纯化得到121株耐酸真菌。以P388肿瘤细胞增殖抑制、抗甲型流感病毒H1N1活性的测试等作为生物活性筛选模型，以TLC和HPLC指纹图谱作为化学筛选模型，采用生物活性测试和化学多样性评价集成筛选这样的方法，最终从耐酸真菌中筛选得到4株耐酸天才真菌，并对其次生代谢产物开展了研究工作。首先通过目标菌株发酵条件的优化，包括培养基，培养时间等，确定了最佳的发酵条件。经过规模化发酵方法分别对4株耐酸天才真菌进行发酵，以乙酸乙酯对发酵液进行萃取，获得发酵提取物。采用天然产物化学的研究方法，即采用正相和反相硅胶柱色谱、制备薄层色谱、SephadexL

3、H．20凝胶柱色谱、HPLC(高效液相色谱)等分离纯化手段，共分离得到67个化合物，具体为从产紫青霉菌(尸P，?fc川f甜聊p“印舢秽胛甜聊)JS03．2l中分离得到18个化合物(1—17，67)；从菌核青霉菌(心，2fcf刀f”mJc彪，D砌，-甜m)zZ07．5中分离得到19个化合物(1粥6)；从产紫青霉菌(PP，zfcf，，f“朋p“印“加矽刀甜聊)ZZ05．4中分离得到17个化合物(37-53)；从灰黄青霉菌(PP刀fcfZ，f甜聊∥西PQ屈～“聊)ZZl0．35中分离得到13个化合物(5“6)。综合运用有机质谱、核磁共振(1HNMR，13CNMR，DEPT，HMQ

4、C，1H．1HCOSYHMBC，NOESY)、CD(圆二色谱)、紫外光谱、红外光谱等现代波谱学技术，以及x．射线单晶衍射、化学法对化合物进行结构鉴定，确定了62个化合物结构，其中28个为新结构。新化合物结构类型有azaphilone类(1-4，21-27，35)，苯并呋喃酮类(6-9)，萘醌类(10)，倍半萜酯类(1扣15)，内酯类(3740)，脂肪酸(41_42)，聚酮类(5S_57)。已知化合物的结构类型涉及azaphilone类(1她O，2妣9，31_34)，倍半萜酯类(16-17)，苯的衍生物(11一13，4¨6)，呋喃衍生物(47_50)，色酮(30)，萜类(35

5、)，内酰胺(51'52)，蒽醌(58)，四氢萘酮类(59“2)等等。运用体外及体内生物活性筛选模型，采用MTT法、SI强法等方法评价所获得的单体化合物的抗肿瘤活性和抗流感病毒H1N1活性；采用琼脂稀释法评价化合物对致病菌的抑菌活性。抗甲型H1N1流感病毒的活性耐酸天才真菌次生代谢产物的研究及酸调作用初探测试表明，化合物2，3，6，11，27对病毒有强效的抑制活性，IC50分别为61．3、64．O、85．3、58．6、25．5∥M，与阳性对照药利巴韦林相当。对于化合物2还进行了动物体内实验，化合物2可以减轻甲型流感病毒感染引起的小鼠肺部炎症，对小鼠起到保护作用，体内评价有效。

6、抗菌实验的结果表明四个倍半萜酯类(14_17)化合物对白色念珠菌均具有中等强度的抑制作用，14、15还对铜绿假单胞菌、产气肠杆菌具有中等强度的抑制活性。为探究氨基酸侧链在抗真菌活性上的作用，化合物17在水解后得到化合物lCL-hydroxyconfertifolin，1O【．hydroxyconfertifolin经测试无抗白色念珠菌活性，证实氨基酸部分对于化合物17的抗白色念珠菌活性是必不可少的。另外，经测试化合物9具有弱的抗产气肠杆菌活性，MIC76．弘M。抗肿瘤活性测试结果表明：化合物19_21，2姐4对神经胶质瘤细胞A172、U87，一对乳腺癌细胞MCF．7、MCF

7、．7／Adr，骨肉瘤细胞MG．63这5种肿瘤细胞均有中等的抑制活性，IC50在2．∞2．3∥M；化合物18对乳腺癌细胞MCF．7有弱的选择性抑制活性；化合物27对A172、U87、MCF．7、MG．63有中等的抑制活性。化合物57对HL．60细胞增殖有强抑制活性，抑制率达89．1％。最后初步探讨了酸调节作用对耐酸真菌次生代谢产物的影响。在不同pH，不同酸性培养基条件下对耐酸真菌进行小试发酵，通过比较菌株次生代谢产物的产量、TLC色谱、HPLc．uV指纹图谱、化合物以及生物活性等，分析酸调节作用对耐酸真菌的次生代谢产