绵羊羊膜上皮细胞的分化潜能及在骨缺损模型治疗中的应用

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1、分类号S852.1学校代码10129UDC号11.220学号2009301027绵羊羊膜上皮细胞的分化潜能及在骨缺损模型治疗中的应用Thedifferentiationpotentialofovineamnionepithelialcellsanditsapplicationintreatmentofboneinjurymodel申请人：朱雪敏学科门类：农学学科专业：基础兽医学研究方向：动物组织胚胎与发育生物学指导教师：曹贵方教授论文提交日期：二〇一二年三月摘要羊膜上皮细胞（amnionepithelialcells，A

2、ECs）是由废弃的胎盘羊膜衍生的具有干细胞特性的细胞。AECs不仅具有多向分化潜能，而且许多研究都证实其具有免疫豁免性，移植后不产生免疫排斥反应，因缺乏末端转移酶端粒，移植后不致瘤，再加上来源广、易获得，不存在伦理争议等，而成为细胞研究工作者的研究热点之一。应用AECs进行一些疑难症的治疗是临床研究工作者的最终目标。临床应用治疗顺利进行的前提是以安全可靠的动物实验为基础。目前，AECs的研究主要以人的为主，在临床治疗研究中以人AECs治疗肝病、肺病、心脏病、糖尿病、神经系统疾病等疑难病症。而绵羊AECs的研究在国内尚未见

3、报道，国外的相关研究也极少。因此，本研究对绵羊AECs的分离培养、干细胞特性的鉴定、体内分化及体外定向诱导分化进行了系统的研究。1.绵羊羊膜上皮细胞的分离与培养实验参照人羊膜消化分离获得原代细胞的方法，对绵羊羊膜的消化分离方法进行了探索，最终选用胰酶替代物TrypLE消化绵羊羊膜分离获得原代细胞，获得的原代细胞活力高，纯度好。细胞培养过程中选用了15%的胎牛血清浓度的培养液进行细胞的培养，很好地维持细胞良好的生长态势。在不同密度梯度培养情况下，通过观察比较，确定了细胞接种的最适密度培养密度范围。在最适密度培养范围内，进行

4、细胞生长周期的观察发现：绵羊AECs的潜伏期是1-2d，指数生长期是3-5d，以后为平台期。通过细胞冻存实验确定了细胞的冻存方案，采用DMSO作为冻存保护剂，FBS：DMSO=9:1的比列为冻存液，并且取-80℃到液氮的简捷冻存途径，有效地保存了绵羊AECs。2.绵羊羊膜上皮细胞的干细胞特性的鉴定采用细胞免疫荧光和RT-PCR技术分别检测绵羊AECs的ES细胞表面标志物Oct-4、SSEA-1、SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60和TRA-1-81及干细胞全能性相关基因Oct-4、Sox-2、Nanog和Rex-

5、1等。检测结果显示绵羊AECs的Oct-4、SSEA-1、SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60和TRA-1-81的ES细胞标志物均有表达。干细胞全能性相关基因Oct-4、Sox-2和Rex-1表达，而Nanog基因未见表达。检测结果提示，绵羊AECs具有干细胞特性的多向分化潜能。3.绵羊羊膜上皮细胞在体外的定向诱导分化研究为了检验绵羊AECs在体外的多向分化潜能，在一定条件下，利用一些外源因子诱导绵羊AECs向神经系统细胞、成骨细胞和脂肪细胞进行定向分化。然后分别用细胞免疫荧光检测和RT-PCR技术、细胞AKP活

6、性检测、茜素红染色、油红O染色等方法进行了诱导分化细胞的鉴定。结果显示：①神经方向诱导分化28d后，细胞免疫荧光显示神经细胞特异性标志物β-III-tubulin和神经胶质细胞特异性标志物GFAP均呈阳性表达；RT-PCR显示nestin和β-III-tubulin和MAP-2等基因均有表达。②成骨诱导分化细胞AKP活性检测显示，诱导分化培养的第28d细胞AKP活性略有升高，第35d开始明显高于对照组，而且随培养时间的延长而继续增高，诱导组和基础培养组差异显著；茜素红染色有明显的钙化结节形成。③脂肪细胞诱导分化的第42d

7、，油红O染色观察到有脂滴形成；细胞内AKP活性检测结果显示，基础培养组细胞AKP活性最高，各诱导组细胞AKP活性明显低于基础培养组。从上述鉴定中细胞的阳性及染色结果和诱导分化细胞的形态特征，可以推测本研究可以将绵羊AECs诱导分化为了表达β-III-tubulin阳性的未成熟神经细胞及MAP-2阳性的成熟神经细胞、GFAP阳性的神经胶质细胞，有钙化结节形成的成骨细胞及有脂滴形成的脂肪细胞。4.绵羊羊膜上皮细胞治疗兔桡骨缺损模型的研究国外有文献报道，将绵羊AECs直接注射到绵羊体内，来治疗绵羊跟腱损伤的报道，且治疗效果极佳

8、。为了进一步检验我们获得的绵羊AECs是否能够在异种动物兔体内进行分化，从而达到类似的治疗效果。手术制作30只兔桡骨13mm缺损模型，随机分成3组，即高剂量组，低剂量组和对照组。将AECs处理后，按设定剂量通过静脉注射进行细胞移植。在细胞移植前、手术后、细胞移植后2周、4周、8周拍摄X光片，细胞移植后的2周、4周、8