慢性应激及邻苯二甲酸酯对睾丸leydig细胞睾酮合成功能影响

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1、温州医学院博士学位论文慢性应激及邻苯二甲酸酯对睾丸Leydig细胞睾酮合成功能影响姓名：袁开明申请学位级别：博士专业：麻醉学指导教师：连庆泉2012-05-27温州医学院博士学位论文中文摘要慢性应激及邻苯二甲酸酯对睾丸Leydig细胞睾酮合成功能影响Leydig细胞作为雄性体内最主要的雄激素来源，其功能正受到了各种环境因素的威胁。其中应激原和增塑剂已被证实可以显著抑制雄性体内睾酮水平，并进一步影响雄性生殖系统发育与功能，但其中机制尚未完全清楚。本研究以成熟Leydig细胞睾酮合成为中心，探讨慢性社会应激和塑化剂邻苯二甲酸酯对其影响及分子机制。实验分为三个部分：(1)大鼠睾丸Leydig细胞再生

2、过程中其特殊基因的鉴定：EDS处理法成熟Leydig细胞(adultLeydigcell，ALC)是唯一能在睾丸中产生雄酮的内分泌细胞，它仅占睾丸细胞的1-5％。成熟Leydig细胞可被EDS(ethanedimethanesulfonate)杀死而又能再生。本研究利用EDS处理后Leydig细胞再生过程模型，检测了Leydig细胞的再生过程中睾丸mRNA表达谱。EDS处理后第7，21，35及90天检测血清睾丸酮水平并检测相应时间点睾丸基因表达。EDS处理后第7天，睾酮水平下降至无法检测的程度，然后逐渐开始恢复。此时，有81个基因表达水平下调2倍或以上，其中48个降到无法检测。这些基因又逐渐开

3、始恢复，并在EDS处理后第90天恢复到正常水平。这些下调至无法检测的基因包括：Star，Scarbl，Cypllal，Cypl7al，胁刃bl，CypIbI和Cyp2al。同时，有89个基因表达水平在第7天上调2倍或以上，其中包括Pkib。这些上调的基因表达水平在EDS处理后第90天又恢复正常。Cyp2al直到EDS处理后第35天才开始恢复，表明该基因可能仅在ALC而不在ALC的前体细胞表达。定量PCR或Westem免疫印记验证了随机选取的部分基因或蛋白变化(2)慢性社会应激对大鼠成熟Leydig细胞睾酮合成功能影响把几只雄性和一只雌性大鼠混合饲养在可监测的洞穴系统(visibleburrow

4、system，VBS)中，可以建立该系统中劣势(subordinate)雄性大鼠社会应激模型。据报道，劣势雄性大鼠与独立饲养的雄性大鼠相比，其血清皮质酮水平升高而睾酮水平下降。而这种应激导致的劣势大鼠Leydig细胞功能下降的机制尚未阐明。本实验比较了VBS中饲养的劣势雄性大鼠、优势(dominant)雄性大鼠以及单独饲养的雄性大鼠，在饲养2天、7天和14天后，各自血清皮质酮、黄6温州医学院博士学位论文体生成素(1uteinizinghormone，LH)、睾酮水平和睾丸基因表达谱差异。结果发现饲养7天和14天后，劣势雄性大鼠与其他两组大鼠相比，血清皮质醇水平显著升高而睾酮水平显著降低。基因表

5、达谱比较结果表明，Leydig细胞在应激7天和14天后，功能较易受到抑制。睾丸中Leydig细胞特有基因，包括清道夫受体bl(scavengerreceptorclassBtypel，Scarbl)，P450胆固醇侧链裂解酶(P450cholesterolsidechaincleavageenzyme，Cypllal)和3D羟甾基类固醇脱氢酶l(3p-hydroxysteroiddehydrogenasel，Hsd3b1)表达水平在应激后显著下调。还有一些与抗氧化应激相关的重要基因(如Cat，Gstml和Utgla6)和与线粒体脂肪酸p氧化相关的基因(如Acaal，Decrl和Echsl)均也

6、在应激后显著下调。总的来说，慢性社会应激与劣势雄性大鼠皮质酮水平升高和Leydig细胞激素生成功能下降密切相关。(3)邻苯二甲酸酯对人和大鼠睾丸3p．HSD以及1713．HSD3活性的抑制作用3p．羟甾基类固醇脱氢酶(313．HSD)和1713．羟甾基类固醇脱氢酶3(1713．HSD3)参与Leydig细胞雄激素生物合成。采用人和大鼠睾丸微粒体观察14种邻苯二甲酸酯对3B．HSD和1713．HSD3的抑制能力，这些邻苯二甲酸酯所含的高分子醇结构中碳链的碳原子数目不同。结果显示，二丙基(DPrP)、二丁基(DBP)、二戊基(DPP)、-(2．丁氧基乙基)(BBOP)和二环己基(DCHP)邻苯二甲

7、酸酯的对人3p．HSD活性抑制的半最大抑制浓度(IC50)分别为123．0，24．1，25．5，50．3和25．50M，对大鼠3B．HSD活性抑制的IC50分别为62．7，30．3，33．8，82．6和24．79M。然而，仅BBOP和DCHP强烈抑制人(ICso，23．3和8．29M)和大鼠(ICso，30．2和9．1州)的1713．HSD3活性。高分子醇结构中碳链的碳原子数为l～2或7～8个的邻