利用改进的最小表达框技术获得抗旱转基因小麦

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1、分类号S514．03学校代码10129UDC65.020.20学号2009202040利用改进的最小表达框技术获得抗旱转基因小麦ObtainingtheDroughtResistanceTransgenicWheatbyUsingtheImprovedMinimalExpressionCassetteTechnology申请人：苏瑞波学科门类：农学学科专业：作物遗传育种研究方向：作物种质资源研究与创新指导教师：马庆教授马有志研究员论文提交日期：二〇一二年五月摘要因基因枪共转化法具有无宿主限制和不受季节时间的限制、简

2、单易操作等优点，目前基因枪共转化法约占所有转基因作物65%以上。采用最小表达框技术转化植物，只导入了包含启动子、编码序列及终止子的表达框序列，不含载体骨架序列，规避了可能由骨架序列引起的安全风险。核基质结合区序列SAR（scaffoldattachmentregion）是真核细胞核的重要组成部分，主要充当遗传信息的传播和转录的功能，具有增强邻近元件的配合，使两个SAR之间的基因片段被界定成一个独立的染色质环状结构，从而阻挡邻近染色质区作用与影响可以提高目的基因的表达特性。为了提高外源基因表达的稳定性，本研究通过在最

3、小表达框序列两端添加SAR序列，构建了表达载体，建立了适合小麦转化的最小表达框转化技术体系。本研究中，首先,以GUS为目的基因，除草剂抗性基因Bar为筛选标记基因，对pSGUS载体进行验证。在此基础上，为了创制抗旱转基因小麦新种质，以来自大豆的抗旱相关转录因子基因GmDREB3为目的基因，Bar基因为筛选标记基因，对济麦22、石366、石B074056、石15四个受体进行转化，具体结果如下：1．科农199为受体进行了基因枪共转化实验，轰击l067个幼胚，获得40株再生植株，PCR检测获得阳性植株9株。随机取4株（编

4、号为M2-1、M2-2、M2-3和M2-4）进行报告基因GUS染色，均在幼根组织染色。进一步对该4个株系的T1代的胚乳（随机取3粒）和小花（随机取3朵）进行报告基因GUS表达检测，发现在胚乳和小花均能检测到GUS的表达，表明利用改良的最小表达框转化技术，外源基因可以在受体中稳定表达。2．GmDREB3基因转化受体小麦济麦22，通过PCR检测获得阳性植株30株，随机取6株进行RT-PCR检测，发现外源基因均能在转录水平上得到表达，进一步通过real-timePCR分析转基因植株的拷贝数，结果显示所得到的阳性植株含有较

5、低的拷贝数。以上结果表明，在最小表达框两端加上SAR序列后，可以显著提高转化片段的完整性及稳定性，减少目标基因整合的拷贝数。3．为确定受体对载体片段的影响及不同受体的表达水平，GmDREB3基因近一步转济麦22、石366、石B074056、石15受体小麦，阳性率分别为：0.53%，0.80%，0.99%和0.31%，表明以石B074056为受体转化效率最高，可见不同受体对加SAR序列最小表达框转化率也有影响。4．经过对以济麦20为受体的转基因GmDREB1材料MG3a、MG7和MG14；以石4185为受体的转基因G

6、mDREB3材料MG2-3和MG3-9；和以济麦19为受体的转基因GmDREB3材料之MG30-5的抗旱生理指标POD和Pro含量的测定，和测产，结果表明MG3-9不论在旱地处理还是水地处理条件下，POD活性及Pro含量均优于2受体和其他转基因株系；产量表现为487.4Kg/666.7m，较对照品种增产13.08%～38.11%，居所有参试品系之首。关键词：SAR序列：大豆DREB基因；GUS报告基因；基因枪转化法；小麦；Pro；PODObtainingtheDroughtResistanceTransgenicW

7、heatbyUsingtheImprovedMinimalExpressionCassetteTechnologyAbstractWiththebiolistictransformationnohostrestrictionsandnon-seasonaltimeconstraints,it’seasytooperatethataccountingformorethan65%ofallgeneticallymodifiedcrops.Usingtheminimalexpressioncassettetechnolo

8、gytransgenicintoplant,whichonlycontainsthepromoter,codingsequenceandterminatorexpressioncassettesequence,toavoidthesecurityrisksthatmaybecausedbytheskeletonsequencewithouttheexclud