北方三省番茄黄化曲叶病毒的检测鉴定及变异分析

《北方三省番茄黄化曲叶病毒的检测鉴定及变异分析》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、山东农业大学硕士学位论文北方三省番茄黄化曲叶病毒的检测鉴定及变异分析姓名：刘文浩申请学位级别：硕士专业：植物病理学指导教师：竺晓平20120612山东农业人学硕二L学位论文中文摘要番茄黄化曲叶病毒(Tomatoyellow饴afcurlvirus，TYLCV)，引起番茄黄化曲叶病。近年来，该病在我国北方大面积发生，严重影响了番茄的产量，已经成为了影响我国番茄生产的首要限制因子。但对于TYLCV的分子变异情况的研究尚不完善，检测体系不够完善而且只停留在定性的水平上，不利于更好的开展关于TYLCV的防治和研究工作。2010～2011年，我们在山东、河南、河北等地的雨肺种植区采集

2、了疑似感染TYLCV的样品，利用双生病毒的通用引物和TYLCV的全长引物扩增得到了30个TYLCV的DNA．A全长序列；优化了PCR和荧光定量PCR的检测体系。主要研究结果如下：1．通过与GENBANK中的其他序列进行比较分析，结果表明，TYLCV分离物在北方地区没有明显的重组现象；一致率比较发现，中国中部和东南沿海地Ⅸ的TYLCV分离物与番茄黄化曲叶病毒以色列株系一致率最高，为98．8％～99．4％；系统进化树表明，北方地区TYLCV分离物属于番茄黄化曲叶病毒以色列株系，且在进化树上可分为三个组，其中lI组主要为山东地区分离物，lIl组主要为河南地区分离物；三个不同省份的

3、TYLCV分离物都呈现出负向选择，核苷酸变异较大；错配分析表明，TYLCV在这三个省处于一种平衡状态；基因交流结果表明，山东和河北地区之间交流最为频繁。2．根据GENBANK上登陆的TYLCV的基因序列设计了三对不同位置的检测引物，通过对TaqDNA聚合酶、退火温度及不同位置引物的灵敏度的优化，得出最佳引物和最优的检测体系：最佳引物为SYl：5’．GTTGAGGAAACTTACG人GCC．3’：SY2：5'-CATTCTTCACTGTTGCGGT-3’，退火温度为55℃，体系为10xPCR缓冲液(含M92+)2．5“L，10mmol／L的上下游引物各1rtL，Taqpoly

4、meraseO．5“L，模板DNA3“L，加重蒸水至25“L。利用该体系在对番茄病样枪测r}1检测到TYLCV。3．根据GENBANK上登陆的TYLCV的基因序列和番茄内源参照基因的序列，设计了SYBRGreen法荧光定量PCR目的引物及内参引物，通过PCR和溶解

5、

6、ll线分析，以及对退火温度和引物浓度的优化，最终确定退火温度为58℃，北方三省器茄黄化曲叶病毒的检测签定及变异分析引物浓度为0．2lamol／L。对感病植株不同部位的病毒含量的检测发现：对彳iI一。W。种的感病植株检测发现，编号为81号的番茄品种对病毒的抗性最差。构建了标准品质粒，通过与普通PCR的灵敏度比较，

7、发现SYBRGreen荧光定量PCR比普通PCR灵敏100倍，生成的标准曲线相关性良好，通过对嫁接不同时问的番茄植株病毒含量的变化检测表明，病毒在22～28d内含量迅速增加。关键词：番茄黄化曲叶病毒；系统进化分析；检测体系：荧光定量PCRn山东农业人学硕十学位论文AbstractTomatoyellowleafcurlvirus(TYLCV)istheviruscausingthetomatoyellowleafcurldisease．Inrecentyears，thisdiseaseoccurredextensivelyin．northChina，causingaseri

8、ousimpactontomatoyield．IthasbecometheprimarylimitingfactorfortomatoproductioninChina．However,researchfortheTYLCVmolecularmutateisimperfect．Besides，thedetectionofvirusonlystaysonaqualitativelevel，whichisnotconducivetocarryingoutthepreventionandresearchofTYLCVDuring2010and2011，we’vecollected

9、samplessuspectedtohavebeeninfectedbyTYLCVinthetomatogrowingareasof．Shandong，Henan，Hebeiandotherplaces．Byusingtheaugmentationofthegeminivirus’universalprimerandthefull—lengthprimerofTYLCV,wehavegot30DNA·Afull·lengthsequencesoftheTYLVC．Meanwhile，we’vealsooptimiz