呼吸道病毒高通量悬浮芯片检测方法建立及新现呼吸道病毒分子特征的分析

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1、天滓医科大学博士学位论文中文摘要第一部分呼吸道病毒高通量悬浮芯片检测方法的建立目的建立常见呼吸道病毒的悬浮芯片检测方法，实现呼吸道病毒的快速、高通量检测。方法(1)建立两组悬浮芯片检测方法，l组为流感病毒悬浮芯片检测方法，用于流感病毒型／亚型检测，包括季节性H1、季节性H3、新现的新甲型H1N1、高致病性禽流感H5及B型流感病毒；2组为常见呼吸道病毒悬浮芯片检测方法，检测15种常见呼吸道病毒，其中包括A、B型流感病毒(FluA、FluB)及新现的呼吸道病毒人博卡病毒(HBoV)、人偏肺病毒(HMPV)、WU多瘤病毒(W

2、UPyV)、NL63型冠状病毒(CovNL63)和HKUl型冠状病毒(CoyHKUl)。(2)引物和探针设计：流感病毒悬浮芯片检测方法(1组)引物和探针参照WHO推荐序列合成。常见呼吸道病毒悬浮芯片检测方法(2组)病毒的引物和探针设计如下：从GenBank下载不同呼吸道病毒的基因序列，用ClustalX进行序列比对后，找到每种病毒的基因保守序列，用Primier5．0和Oli906．0软件在保守区设计引物和探针，尽量使不同病毒引物Tm值接近，引物扩增的目的片段大小在100bp．300bp之间。同时采用Oli906．0软

3、件对设计好的引物进行引物二级结构及互相之间形成引物二聚体的能力进行评价，根据评价结果将15对呼吸道病毒引物分为两个pool，用于多重PCR扩增。对探针序列进行blast比对，评价其特异性。(3)探针与微球耦联：按照微球供应商提供的方法进行探针与微球的耦联，并用倍比稀释的与探针互补的validationoligo进行耦联效果评价。1组用与季节性H1、H3、新甲型H1N1及B型流感病毒探针互补的validationoligo进行了耦联效果评价，2组用与OC43型冠状病毒(CovOC43)、HMPV、FluA及FluB探针互

4、补的validationoligo进行了耦联效果评价(4)多重PCR扩增及杂交条件优化：1组为5重PCR扩增，2组分为两个pool，1个为7重PCR扩增，另1个为8重PCR扩增。通过不同退火温度及引物浓度组合，优化反应条件及引物浓度。优化多重PCR反应条件后，在不同温度下将FCR产物与耦联有探针的微球进行杂交，用Bio．Flex200检测仪进行检测，优化杂交温度。标本荧光强度值(姗I)=阴性对照标本5倍判断为阳性。天津医科大学博士学位论文(5)用本实验室保存的不同型／亚型的流感病毒毒株(H5亚型除外)按TCIDS0(半

5、数组织细胞感染量)倍比稀释后进行1组悬浮芯片检测，评价敏感性和特异性。对本实验室保存的14种常见呼吸道病毒(副流感病毒2型(PⅣ2)除外)阳性标本及灭活H5亚型流感病毒培养液进行RT-PCRfPCR扩增，PCR产物纯化、定量后，10倍系列稀释核酸进行2组悬浮芯片检测(H5亚型纯化产物稀释液进行1组悬浮芯片检测)，评价所建立方法的敏感性和特异性。(6)临床标本验证实验：按照以上建立的方法，对2009年1月采集的8份及2010年2月采集的100份流感样病例(ILI)的咽拭子标本进行1组悬浮芯片检测，并与WHO推荐的Real

6、．timePCR方法检测结果进行比较。对2008年9月"～2009年12月采集的88份下呼吸道感染患者的鼻咽吸取物(NPA)标本进行2组悬浮芯片检测，并与单引物PCR(检测HBoV及WUPyV)和多重PCR试剂盒(Seegeen，韩国)检测结果进行比较。结果．(1)单引物PCR验证引物：用设计的不同呼吸道病毒特异的引物对已知呼吸道病毒阳性的标本进行单引物PCR扩增，均扩增出目的条带，说明设计的引物可用于后续多重PCR方法建立。(2)探针与微球耦联：不同稀释度vallidationolligo与微球杂交后MFI值均与va

7、llidationolligo的稀释倍数成正比，最高稀释度的vallidationolligo与微球杂交后MFI值也在700以上，说明探针与微球耦联成功。(3)多重PCR扩增条件及杂交温度优化：用不同型／亚型流感病毒和已知病毒阳性的标本核酸进行梯度多重PCR扩增，1组和2组多重PCR的最佳退火温度分别为60℃和62℃。通过不同引物浓度组合比较，确定了多重PCR的最佳引物浓度。1组和2组悬浮芯片检测方法的最佳杂交温度分别为54℃和50℃。(4)敏感性：1组悬浮芯片检测方法的敏感性为季节性H1N1亚型5TCID50／mL、

8、季节性H3N2亚型0．05TCID50／mL、新甲型H1N10．05TCID50／mL、B型5TCID50／mL及H5亚型10嗡neJpL,2组悬浮芯片检测方法的敏感性为HMPV10一ng／肛L、HBoV10一ng／pL、WUPyV10一ng／pL、Adv(腺病毒)10一ng／pL、CoyOC4310一ng／pL、Cov229E(