cd45单抗介导淋巴瘤荷瘤裸鼠三步法预定位放免显像的研究

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1、CD45单抗介导的淋巴瘤荷瘤裸鼠三步法预定位放免显像研究硕士研究生：汪兵指导老师：李贵平主任医师、副教授摘要【目的】1、建立DTPA．生物素和hlgG的99mTc标记方法，并观察99‘。ITc标记物在体内、外的稳定性及其在正常小鼠体内的分布。2、评价生物素化CD45单抗及咖Tc标记生物素在人Raji细胞移植瘤裸鼠模型中三步法预定位放免显像价值。【材料与方法】1DTPA．生物素和hlgG的99mTc标记及其在正常小鼠体内生物分布研究1．1实验动物4-6周龄昆明种小白鼠24只(雌雄不限)，质量19．

2、219，由南方医科大学实验动物中心提供。1．299mTc标记DTPA．生物素99mR标记DTPA．生物素采用直接标记法，纸层析法测定其标记率，固定相为新华1号虑纸，展开剂为丙酮和生理盐水，分别在标记后Oh、lh、3h、6h、12h采用纸层析法测定放化纯度。1．3"mTc标记hlgG99mTc标记hIgG采用巯基乙醇直接还原法，纸层析法测定其标记率，固定相为新华1号滤纸，展开剂为30％氨水：乙醇：水(1：2：5)和生理盐水，分别摘要在标记后Oh、1h、3h、6h、12h采用纸层析法测定标记率及放化

3、纯度。1．4"mTc．DTPA．生物素和99mTc．hlgG的体外稳定性实验分别取500lal的99mTc．DTPA．生物素和99mTc．MgG溶液，加入1IIll的生理盐水(NS)中，放置37℃温育箱中温育至12h，分别于1h、3h、6h、12h取样，用纸层析法测定放化纯度。1．599mTc．DTPA．生物素和99mTc．hlgG在正常小鼠体内的生物分布及显像取24只昆明种小白鼠，随机分为2组，每组12只小鼠，第一组为静脉注射99rote．DTPA．生物素组，第二组为静脉注射99mTc．hIg

4、G簦]．。每组于尾静脉注射7．4MBq／1001al的99mTc标记物后1h、3h、6h和12h各取3只小鼠分别进行体步'bSPECT显像，于显像后断颈处死，取肝、脾、肾、肺、胃、肠、肌肉、骨骼及血液，称重后在放射免疫Y计数器中测量放射性计数，经放射性衰变校正后计算各脏器的每克组织百分注射剂量率(％ID／g)。2CD45单抗介导的淋巴瘤荷瘤裸鼠三步法预定位放免显像研究2．1Raji细胞株Raji细胞株由南方医科大学南方医院血液科提供。用RPMll640培养液培养，加入10％胎牛血清，在37"C和

5、5％C02和95％相对湿度的孵箱内孵育。2．2流式细胞仪检测Raji细胞CD45表达收集对数期生长的Raji细胞，PBS洗涤2次，计数细胞，分管，106／管，加入CD45单抗，同型IgGl作为阴性对照抗体，4"C孵育30min，PBS洗涤，用流式细胞仪分析样本中阳性细胞数，计算荧光标记阳性细胞的百分率。2．3建立淋巴瘤实验动物模型(1)4．6周龄裸鼠24只(雌雄不限)，质量18—22g，由广东省实验动物中心和南方医科大学实验动物中心提供。(2)收集对数期生长的的Raji淋巴瘤细胞株并离心，生理盐

6、水制成悬浮液(>lx108／mE)，每只裸鼠双侧臀部皮下注入0．2ml，无特定病原体(SPF级)环境下饲养，待肿瘤细胞种植于裸鼠臀部皮下后，记录肿瘤成瘤时间，成瘤后每2天n硕士学位论文用游标卡尺测量肿痛最长径羽最短径b。2．4生物素化CD45单抗的制备取2mgCD45单抗，按CD45单抗：生物素酯(摩尔比)=1：30．1：50取样，在0．1MPH8．5碳酸氢钠溶液中反应(Iml)，室温下用玻璃棒轻轻搅拌l小时，将反应液注入PD．10层析柱内，放入离心器中(3000转／minx2次)离心层析。2．

7、5采用HABAJAvidin试剂进行抗体CD45生物素化程度测定取收集的生物素化CD45单抗1001．tl，加入900ul的HABA／Avidin试剂中进行反应。由于游离的生物素与HABA／Avidin发生反应约1分钟后，当反应体系的颜色由橙红色转为淡黄色时，测量其500nm的OD值。抗体生物素化程度的计算(根据HABA／Avidin试剂说明书)2．699mTc标记生物素及”mTc标记CD45单抗参见标记部分。2．7淋巴瘤荷瘤裸鼠三步法预定位体内生物分布测定取人lhji细胞移植瘤裸鼠12只，每个

8、时间点3只裸鼠，尾静脉注射生物素化CD45单抗lOOItg／100pL，48h后尾静脉注射亲和素(Avidin)200p∥100pL，再过48h尾静脉注射9帅Tc．DTPA．生物素7．4MBq(20lag／1001a1)，注药后1h、3h、6h、12h断颈处死裸鼠后，取肝、脾、肾、肺、胃、肠、肌肉、骨骼、血液及肿瘤，称重后在丫计数仪中测量放射性计数，经放射性衰变校正后计算各脏器的％ID／g及肿瘤／非肿瘤(T／NT)比值。2．8淋巴瘤荷瘤裸鼠三步法预定位放免显像取淋巴瘤荷瘤裸鼠6只，随机分为2组，