竞争定量rtpcr检测铜对猪垂体ghmrna表达水平的影响

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1、124肚科学发展观促进科技创新(上)竞争定量RT—PCR检测铜对猪垂体GHmRNA表达水平的影响李家奎华中农业大学动物医学院，湖北武汉，430070摘要采用竞争定量RT—PCR检测铜对猪垂体GHmRNA表逸水平的影响。45头体重20kg左右的“军牧1号”白猪，分成A、B、C组，C为对照组，饲以基础日粮，A、B分别饲以添加125mg／kg和250mg／kg铜(硫酸铜)的日粮，检测铜对猪的生长性能和垂体GHmRNA表达水平的影响。结果表明：目粮中添加两种水平铜均能促进仔猪的生长，提高饲料利用率提高垂体GHmRNA表迭水平。铜对猪的促生长作用是通过提高垂体GHmRNA表达水平近

2、而促进GH的合成与分泌实现的。关键词铜猪竞争定量RT—PCR基因表达铜作为生长促进剂在养猪生产中普遍应用。但由于通过猪肠道的铜绝大部分不被吸收而排出体外，由此所造成的环境污染和资源浪费已日益引起广泛关注，因此研究铜促进猪生长的机理，降低铜添加的水平，对于减少高铜所造成的危害和开发新型的生长促进剂具有十分重要的意义。目前的研究表明，高铜促进猪生长的铜与抑菌作用、增加采食量、提高含铜酶的活性、调节内分泌功能等因素有关。研究表明高铜有提高猪垂体GHmRNA水平的趋势，但同时指出该结论尚需采用更为精确的方法验证。为此，本研究以断乳“军牧1号”白猪为试验对象，探索铜促进猪生长的适宜

3、浓度，并采用竞争定量PCR方法研究高铜对猪垂体GHmRNA水平的影响，研究铜促进猪生长的机理。一、材料与方法(一)材料硫酸铜(化学纯，上海绿源化工公司)，Trizol(Invitrogencompany)．SuperScriptII(LifeTechnoIo—gies，Gibco)，LATaqDNApolymerase(TaKaRa，Japan)，dNTP(上海生工)等。(二)试验动物“军牧1号”白猪45头，体重20kg左右，雌雄不拘。试验日粮按仔猪营养需要配制成颗粒饲料，配方和营养水平见表1。(三)试验方法1．饲养试验实验猪编号，常规免疫、驱虫，随机分成A、B、C三组，

4、每组15头，调整各组体重无差异，预试3d。C组为对照组，饲以基础日粮；A、B分别于基础日粮中添加125mg／kg、250mg／kg硫酸铜。实验进行35d，实验期间猪只自由采食饮水。实验过程中记录猪的采食情况，实验终了，空腹称重，测定猪的生长性能，每组各取三头猪宰杀，无菌采集垂体，液氮冻存，备用。以科学发展观促进科技创新(一)1252．垂体GHmRNA表达水平的检测采用竞争定■PCR方法(1)垂体总RNA的提取和反转录采用Trim[一步法提取总RNA，SpmartSpec3000测定RNA浓度，以A260nm／A280nm判定纯度．各实验组总RNA均取2．099，加2pmo

5、l／L(oligdT)2pL。加入ddH：O使反应体积为9pL，70℃lOmin后立即冰浴，加入5×RT缓冲液4,uL，2．5mmol／LdNTPs49L，逆转录酶SuperScriptII1pL，使反应混合物总体积达到20pL，然后42℃逆转录50min，70℃15min，冰浴后一20℃保存cDNA．(2)竞争性模板的构建根据GENEBANK中发表的猪cDNA(编号：SSl9788)序列，用DNAsis设计一对引物，上游引物：57一TTTCGCCCTGCTCTGcCTGCCCTGGACT一3’，下游引物：5’一ACAGCT—GcTcTCCACGAAGCC,GCGAGAC

6、一3’，通过RT—PCR方法从猪垂体mRNA扩增一个607bp片段，将其克隆于pMD一18Tvector。用DNAsls对扩增的片段进行分析，该片段上存在两个APaI酶切位点，用APaI酶切连接于载体上的该片段，切去212bp，闭合质粒，形成一个保留上下游引物序列的395bp竞争模板，扩增竞争模板，回收产物，测定浓度，稀释备用。(3)垂体GHmRNA表达水平的竞争性定量PCR测定：A、B、C三组各三头猪的垂体，提取总RNA，反转录后取产物2止进行PCR扩增，在259L的反应体系中含有ddH：012．3pL，2．5VLl0×PCRbuff—er，1．5mm01]LMgCl2

7、2vL，0．2mmol／LdNTP49L，10pmol／LGH的上游引物和下游引物各1“L，1．OUT．agDNApolymerase。根据多次对PCR反应条件，循环次数等的实验结果，PCR反应采用的最佳条件为：9512预变性5min；9412变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1rain，共25个循环；72℃延伸10min。每个反应体系中加入竞争模板0．02ng。PCR反应在Tpermr,212000PCR仪(Biometra，Gem∞)上进行。反应结束后，取5txLPCR产物在2．0％EB染色的琼脂糖凝胶上电泳。图像处