鞘内注射pdtc对神经病理性痛大鼠trpm8受体表达的影响

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·1102·临床麻醉学杂志2018年11月第34卷第11期JClinAnesthesiol,November2018,Vol.34,No.11·实验研究·鞘内注射PDTC对神经病理性痛大鼠TRPM8受体表达的影响李周睿曹欣娅秦榜勇李清梅刘晓红【摘要】目的探讨NF-κB参与TRPM8受体在大鼠神经病理性痛觉调制中的作用。方法鞘内置管成功的SPF级健康雄性SD大鼠36只,4~6周龄,体重180~200g,采用随机数字表法分为三组:假手术组(S组)、神经病理性痛组(NP组)和NF-κB阻滞剂PDTC组(PDTC组),每组12只。鞘内置管成功后第3天,NP组和PDTC组采用坐骨神经缩窄性损伤(chronicconstrictioninjury,CCI)法制备大鼠神经病理性痛模型;S组只游离坐骨神经不做损伤处理。三组大鼠术后1d开始连续鞘内注射,连续14d(2次/天),PDTC组鞘内注射PDTC20μg/10μl(20μgPDTC溶于10μl生理盐水),注射完成后10μl生理盐水冲管,S组和NP组分别鞘内注射等容量生理盐水,三组大鼠分别于术前1d、术后1、3、7、10和14d鞘内给药后30min测定冷痛阈、热痛阈和机械痛阈。分别在术后7、14d处死大鼠,采用Westernblot法检测背根神经节(DRG)中TRPM8受体和NF-κBp65蛋白含量。结果与S组比较,术后1~14dNP组冷痛阈明显降低、热痛阈明显缩短、机械痛阈明显降低(P<0.05);与NP组比较,术后3~14dPDTC组冷痛阈明显增多、热痛阈明显延长、机械痛阈明显升高(P<0.05)。与S组比较,术后7、14dNP组TRPM8受体和NF-κBp65蛋白含量明显升高(P<0.05);与NP组比较,术后7、14dPDTC组TRPM8受体和NF-κBp65蛋白含量明显降低(P<0.05)。结论大鼠DRG中TRPM8和NF-κBp65表达上调参与神经病理性痛的发生发展,抑制NF-κB活化可以减少TRPM8受体的表达上调并且改善大鼠痛觉过敏的症状。【关键词】瞬时受体电位通道;TRPM8;神经痛;神经节,脊;NF-κBEffectsoftransientreceptorpotentialchannel8withintrathecalinjectionofPDTCinratswithneuro-pathicpainLIZhourui,CAOXinya,QINBangyong,LIQingmei,LIUXiaohong.DepartmentofPainMedicine,theAffiliatedHospitalofZunyiMedicalCollege,Zunyi563000,ChinaCorrespondingauthor:QINBangyong,Email:qbyzy@163.com【Abstract】ObjectiveToinvestigatethemechanismandtheroleoftransientreceptorpotentialchannel8withtheinvolvementofnuclearfactorkappaBinmodulationofneuropathicpaininrats.MethodsThirty-sixspecialpathogen-freehealthyadultmaleSprague-Dawleyratswithsuccessfulin-trathecalcatheterimplantation,weighing180-200g,aged4-6weeks,weredividedinto3groups(n=12each)byusingarandomnumbertable,respectively,shamoperationgroup(groupS),neu-ropathicpaingroup(groupNP)andNF-κBbockerPDTCgroup(groupPDTC).Thethirddayafterintrathecalcatheterwassuccessfullyimplanted,neuropathicpainmodelwasmadefromgroupNPandgroupPDTCbasedonchronicconstrictioninjury(CCI),GroupSwasonlyisolatedthetrunkofsciaticnervewithoutligation.PDTC20μg/10μl(20μgPDTCwasdissolvedinphysiologicalsaline)stwasintrathecallyinjectedtwiceadayonthe1postoperativedayandtheinjectionlastedforthenext13daysinthethreegroups.Aftertheinjection,10μlphysiologicalsalinewasusedtorinse.GroupSandgroupNPwereintrathecallyinjectedequalvolumeofphysiologicalsalineand30minutesafterin-trathecaladministration,thecoldpain,thermal,andmechanicalthresholdsweremeasuredonpreop-erativeday1andpostoperativedays1,3,7,10and14inthethreegroups.Theratsweredispatchedandthedorsalrootganglionswereremoved7and14daysafteroperationfordeterminationoftheex-pressionofTRPM8andNF-κBp65byWesternblot.ResultsThecoldpain,thermal,andmechanicalthresholdsweresignificantlydecreasedonthefirstpostoperativedayofconstrictioninjuryandthecasecontinuedforthenext13days.TheexpressionofTRPM8andNF-κBp65indorsalrootDOI:10.12089/jca.2018.11.015基金项目:国家自然科学基金(81450054);贵州省科技厅联合基金([2014]7583)作者单位:563000贵州省遵义医学院附属医院疼痛科[李周睿(现在常州市第二人民医院)、曹欣娅、秦榜勇],麻醉科(李清梅);遵义医学院基础医学院生理学教研室(刘晓红)通信作者:秦榜勇,Email:qbyzy@163.com 临床麻醉学杂志2018年11月第34卷第11期JClinAnesthesiol,November2018,Vol.34,No.11·1103·ganglionswassignificantlyincreased7and14daysafteroperationingroupNP.Thehyperalgesiawasremarkablyreduced3-14daysafteroperationinPDTC.Theintrathecally-injectedNF-κBblockercouldeffectivelyblocktheup-regulationoftheexpressionofNF-κBp65andTRPM8indorsalrootganglions.ConclusionTheup-regulationofexpressionofTRPM8andNF-κBp65indorsalrootgan-glionsisassociatedwithneuropathicpain,andinhibitingtheactivationofNF-κBcanrelievetheup-regulationoftheexpressionofTRPM8aswellasthehyperalgesiaofrats.【Keywords】Transientreceptorpotentialchannels;TRPM8;Neuralgia;Ganglia,spinal;NF-kappaB神经病理性疼痛是躯体感觉神经系统的损害大鼠活动情况,未出现运动障碍,经导管注射2%或疾病导致的疼痛,常有3种表现形式:痛觉过利多卡因10μl,30s内出现双后肢瘫软,并在30敏、痛觉超敏和自发疼痛。其发病机制复杂,且临min内恢复,置管成功,分笼单独饲养,术后3d内床治疗效果欠佳。冷痛觉过敏是神经病理性疼痛每天常规腹腔注射青霉素2×105U预防感染。的重要特征,中枢和外周神经元的异常兴奋是冷痛大鼠神经病理性痛模型的制备鞘内置管成[5]觉过敏的病理基础,但其具体发生机制尚未完全清功3d后,参照Bennett等方法制备大鼠神经病楚。冷刺激瞬时电位受体第8亚型(TRPM8)是瞬理性痛模型。腹腔注射4%水合氯醛10ml/kg,于时电位受体(TRP)离子通道的一种亚型,可被冷刺股骨后暴露右侧坐骨神经干,间隔1mm松扎4激(8~28℃)激活。神经病理性疼痛状态下伤害感处,结扎强度以引起小腿肌肉轻微颤动为宜。NP受神经元中TRPM8的表达增加,功能增强,非伤组和PDTC组采用CCI法制备大鼠神经病理性痛害性冷刺激可引起这些神经元兴奋并导致冷触觉模型,S组只分离坐骨神经,不结扎。参照文献[1]超敏而诱发疼痛。NF-κB是多条信号传导通路[6],三组大鼠术后1d开始连续给药,2次/天,间的中心环节,参与炎症、免疫、应激和组织细胞凋亡隔12h,设定给药时间为8∶00和20∶00。PDTC组等病理生理过程,在神经病理性疼痛的发生发展中鞘内注射NF-κB阻滞剂PDTC(Sigma)20μg/10μl[2-3]起重要作用。本研究拟通过评价背根神经节(20μgPDTC溶于10μl生理盐水),注射完成后(dorsalrootganglion,DRG)中TRPM8受体与10μl生理盐水冲管,S组和NP组分别鞘内注射等NF-κB的关系,探讨坐骨神经缩窄性损伤(chronic量生理盐水。constrictioninjury,CCI)大鼠神经病理性痛痛觉调痛阈的测定于术前1d、术后1、3、7、10和14制的可能机制。d鞘内给药后30min时测定。(1)冷痛阈:将冷板[7]温度控制在(4±1)℃,按Jasmin等方法将大鼠材料与方法放在冷板上,并罩在一个有机圆筒内,稳定5min,实验动物与分组鞘内置管成功的SPF级健待大鼠探究活动基本消失后记录5min内的术侧后康雄性SD大鼠36只,4~6周龄,体重180~200肢抬爪次数(大鼠活动或体位变化时抬爪不计入g,购自陆军军医大学动物中心[许可证号SCXK内),抬爪次数增多,冷痛阈降低,抬爪次数减少,冷(渝)2012-0005]。22~26℃、昼夜交替环境中分笼痛阈升高。(2)热痛阈:将大鼠置于笼内,适应环饲养,适应环境1周。禁食4h,自由饮水。本实境后,使用TF2-光热测痛仪测定,将光辐射焦点对验严格按照国家疼痛学会关于应用动物进行疼痛准术侧后肢掌中央,记录从照射开始至术侧抬足时研究的伦理纲要进行操作。采用随机数字表法分间,最大时限为30s。重复6次,每次间隔时间为为三组:假手术组(S组)、神经病理性痛组(NP组)5min,去掉最大值和最小值,取平均值为热痛阈。和NF-κB阻滞剂PDTC组(PDTC组)。(3)机械痛阈:将大鼠置于笼内,适应环境后,将[4]鞘内置管参照Choi等方法行鞘内置管,2390系列电子vonFrey探头对准术侧后肢足掌中腹腔注射4%水合氯醛10ml/kg麻醉,俯卧位固央,垂直向上均匀施加压力,后肢抬起即为完成1定,术区备皮消毒,沿L4-6间隙作长约2cm的皮肤次测定,为避免机械刺激损伤,每次测定时间不超切口,逐层分离筋膜、棘突间韧带及肌肉,充分暴过2s,测定仪自动显示检测结果,重复6次,每次露棘突间隙,将无菌的PE-10导管经棘突间隙向头测量间隔5min,去掉最大值和最小值,取平均值端置入2~3cm,脑脊液溢出后封闭导管,经皮下即为机械痛阈。固定在颈背后,逐层缝合伤口。置管后1d,观察TRPM8受体和NF-κBp65蛋白含量检测分 ·1104·临床麻醉学杂志2018年11月第34卷第11期JClinAnesthesiol,November2018,Vol.34,No.11别于术后7、14d腹腔注射10%水合氯醛麻醉,断术后3~14dPDTC组冷痛阈明显升高、热痛阈明头处死,取出术侧L4-6DRG组织,立即放入液氮中显延长、机械痛阈明显升高(P<0.05)(表1)。冷冻保存。组织充分匀浆,4℃摇床60min,4℃TRPM8受体和NF-κBp65蛋白含量与S组下12000r/min离心30min,取上清。考马斯亮蓝比较,术后7、14dNP组TRPM8受体和NF-κB法测定蛋白浓度。取各组蛋白样品40μg,行SDS-p65蛋白含量明显升高(P<0.05);与NP组比较,PAGE凝胶电泳,转至PVDF膜。6%脱脂奶粉室术后7、14dPDTC组TRPM8受体和NF-κBp65温封闭2h,分别加入一抗:兔抗NF-κBp65多克隆蛋白含量明显降低(P<0.05)(图1—2)。抗体(1∶200),山羊TRPM8多抗(1∶500)同时加入讨论鼠抗β-actin多抗(批号:NB600-501)2.5μl,使体积比为1∶2000,摇匀后室温反应1h。4℃孵育过本实验参照文献[5],采用CCI法制备大鼠神夜。pH值7.2的PBS洗膜。加入二抗:抗兔经病理性痛模型。结果表明,与S组比较,NP组HRP-IgG(1∶2500,批号:ab97051)和抗鼠HRP-术后1~14d时冷痛阈明显降低、热痛阈明显缩短、IgG(1∶2500,批号:ab6789),室温反应1h。PBS机械痛阈降低,神经痛行为学表现明显,显示大鼠洗涤15min×1次+5min×4次。混合等体积神经病理性痛模型制备成功。Bottle1和2与PVDF膜共孵育1min后,曝光、显冷刺激瞬时电位受体第8亚型(TRPM8)主要[8]影、定影。X射线曝光显影,β-actin为内参照,使分布于三叉神经节和DRG的小直径神经元,能用扫描分析系统软件分析数据,以目的蛋白条带灰感受冷刺激及参与炎症和神经病理性疼痛的痛觉度值与β-actin条带灰度值的比值反映目的蛋白调控,因此也称为冷敏感通道。生理情况下,TR-含量。PM8主要发挥感知寒冷的作用,传导无害冷刺激统计分析采用SPSS17.0软件进行分析。以启动机体冷感知,从而实现体温调节和无痛感正态分布计量资料以均数±标准差(x􀭺±s)表示,冷知,但在病理条件如炎症或神经损伤等情况下,痛阈、热痛阈、机械痛阈的比较采用双因素方差分TRPM8则可传递刺激信号并发挥伤害防御作用。析,其他指标组间比较采用单因素方差分析。P