内皮素受体a+sirna对大鼠肾脏缺血再灌注损伤保护作用的研究

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1、复E大学《±学＆*立发的基因沉默现象t其机制是通过阻碍特定基因的翻译或转录来抑制基因表达。当细胞中导入与内源性m刚A编码区同源的职链烈A时，该删^发生降解而导致基因表达沉默“⋯。在哺乳动物中长度为21～23nt的小RNA分子是引起RNA干扰现象的直接原园⋯”1。这种小RNP,分子被称之为小干扰RNMsmailinterferingRNA，siRNA)。在RNA干扰中一个非常重要的酶是RNaseIII核酶家族的Dicer。它可与双链RNA结台，并将其剪切成21～23nt及3’端突出的小分子RNA片断．即siRNA。随后sil

2、ⅫNA与若干个蛋白组成的，RNA引起的称之为RNA诱导沉默复合体(RNA_inducedsi[encingcomplex，RISC)结合，解旋成单链，并由该复合体主导RNAi效应“⋯。RISC被活化后．活化型RISC受已成单链的siRNA引导，序列特异性地结合在标靶mRNA上并切断标靶IIlRNA，{{拄靶mRNA的特异性分解。由此．可达成特异性的转录后基因沉默从而抑制相关蛋白的表达。因此，RNAi在基因功能研究以及疾病治疗方面有者巨大的价值。基因治疗是一种将特殊基因转染至靶细胞以调节目的基因表达的治疗形式。基因治疗的前提

3、是如何特异性的将目标基因进达靶器官、靶细胞，而在运送的过程中又不会被降解。RNAi作为一种基因治疗手段面临着同样的问胚。化学台成的siRNA易降解．作用时间短暂，不适于体内应用。体内的PdoAi研究往往需要一种安全，转染效率高，作用时间相对较长，靶向性强的载体。就肾脏基因治疗而言，主要包括非病毒载体，病毒载体种类型““。非病毒载体包括襟质粒(nakedplasmid)和增强的裸质粒(enhancednakedplasmid)。由于裸质粒的转染效率普遍较低，因此有一些增强其转染效率的方法。主要包括两类，一类是物理方法．包括使

4、用电穿}L法在细胞膜上制造临时的微孔，以及对靶器官进行加用微泡剂的超声干预：另一类是化学方法，主要是指使用各种脂质体，包括病毒融合的脂质体(如HvJIiposome)。病毒载体，包括腺病毒，腺相关病毒，逆转录病毒以及慢病毒等。虽然病毒载体在转染效率上较非病毒载体明显增强，f黾其毒性和免疫原性的问题仍待解决‘“。本课题采用质粒载体介导的针对ETRA的siRNA．在体外试验中筛选能高效抑制肾脏ETRA基因表达的siRNA。利用大鼠肾脏缺血_冉灌注损伤模型，研究ETRAsiRNA对肾脏缺血再灌注损伤的保护作用．并对其作用机制进行

5、初步探索。——!!!!!．!!!!!第一部分质粒介导的ETRAsiRNA的构建及体外筛选材料与方法l实验材料11细胞与试剂(1)细胞系：A—10(大鼠胸主动脉平滑肌细胞)购自ATCC。(2)主要试剂iDMEM低糖培养基Hyclone公司2．胎牛血清(Fetalcalfserum)Hyclone公司3．胰蛋白酶(Trypsin)Gibco公司4pRNATU61／Neo质粒载体Genscript公司5．质粒抽提试剂盒Qiagen公司6．LipofectaalineLTX转染试剂Invitrogen公司7．OptiMEMIRed

6、ucedSerumMediumInvitrogen公司8胎牛血清Hyclone公司2主要设备1．HeraeusC02恒温培养箱Heraeus公司2．倒置显微镜Olympus公司3荧光显微镜Olympus公司4超净工作台苏州净化设各公司5．恒温水浴箱PolyScience公司6．Milli—QBiocel纯水仪m11ipore公司7手提紫外灯upland公司8电泳仪(BioRadPower／PAC3000)BioRad公司9．GelDoe2000GelOocumentfltionSystemBioRad公司10．一80X2低

7、温冰箱(HetoUltraFreeze)HetoUltra公司1I．EppendorfBiophotometerEppendorf公司12．GeneAInpPCRSystem2400PerkinElmer公司t3．Centrifuge5840R低温离心机Eppendorf公司复B大学硕士学位论文司4Rotor—Gene3000荧光定量PER仪CorbettResearch公2．实验方法2lA—lO细胞的复苏和传代21_1细胞的复苏将液氮罐中取出的A10细胞冻存管迅速置于37"C水浴中，使冻存细胞快速融化，1000rpm离心

8、10min，细胞沉淀用lmI含10％胎牛血清DMEM低糖培养基重悬后．细胞悬液移入6cm培养皿．加培养液至总体积至3m】，置于37"C、5％c0：、饱和湿度细胞培养箱中进行培养。24h后于倒置显微镜下观察细胞是否贴壁生长。212细胞的培养及传代贴壁生长的细胞2～3天更换培养液一次，细胞汇片达7080％时