tgfβ1、vegf、cd105在结直肠癌中的表达与临床意义

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1、TGF-B1、VEGF、CDl05在结直肠癌中的表达及临床意义引言袭和转移。大多数实体肿瘤表达VEGF，其表达受缺氧和肿瘤基因的调控【8～。微血管密度(micro．vesseldensity，MVD)是衡量血管生成的定量指标，自1991年Weidner等首次报道利用测定肿瘤组织中微血管密度来定量评价肿瘤血管生成水平以来Il们，人们已发现许多肿瘤微血管密度与肿瘤转移呈正相关，而与生存时间呈负相关。CDl05(Endoglin，EDG)是一种新发现的内皮细胞标记物，在处于增殖状态的肿瘤组织血管内皮细胞，即新生的血管内皮细胞上强表达，

2、对非新生血管内皮细胞几乎不表达【l”，因而更具有特异性，能更准确反映内皮细胞的增殖状态，从而判断肿瘤血管是“新生的”还是“非新生的”。本课题运用免疫组织化学的方法检测TGF．131、VEGF、CDl05在结直肠癌手术标本石蜡切片中的表达情况，并分析其相关性，探讨它们在结直肠癌发生发展中的作用机制及与结直肠癌临床病理参数间的关系，旨在对结直肠癌的诊断、恶性程度的判定、预后分析及生物学治疗提供有效的理论依据。2TGF-Bl、VEGF、CDl05在结直肠癌中的表达及临床意义材料与方法一、材料来源本研究所用病例来自苏州大学附属第二医院及

3、部分外院2000～2002年间结直肠癌手术标本且临床资料齐备者52例，患者年龄30～80岁，平均54．484-12．83岁，其中男性32例，女性20例。结直肠癌按照Dukes分期标准进行分期，A期3例，B期25例，c期22例，D期2例，组织学分级为高分化腺癌(G1)ll例(图4)，中分化腺癌(G2)20eJ(1蛩5)，低分化腺癌(G3)21例(图6)。其中伴有淋巴结转移者31例，无淋巴结转移者21例。随机选取10例非肿瘤性结直肠组织作为对照。所有标本经10％福尔马林固定，常规石蜡包埋，4um厚连续切片，进行免疫组织化学染色。二、

4、主要试剂及仪器1、兔抗人TGF一131多克隆抗体、兔抗人VEGF多克隆抗体和鼠抗人CDl05单克隆抗体均为美国ZYMED公司产品，购自福卅l迈新生物技术开发有限公司。上述三种抗体均为即用型抗体。2、S．P试剂盒(包括：A．过氧化物酶阻断剂；B．正常动物非免疫血清；C．生物素标记的第二抗体；D．链霉素抗生物素蛋白．过氧化物酶溶液；F．DABkit显色剂)均为福州迈新生物技术开发有限公司产品。三、免疫组织化学染色步骤主要参照试剂公司试剂盒说明书进行，对切片行高温高压处理促进抗原暴露。主要工作流程如下：1．4um厚石蜡切片，贴附于涂有

5、多聚赖氨酸的载玻片上，600C烤片2h。2．二甲苯脱蜡，递减梯度酒精至水。3．O．05M(PH7．2)PBS洗5min。4．抗原修复，于高压锅内放入适量IM柠檬酸缓冲液抗原修复(PH6．0)，将切片放入，加热待沸腾后放汽并持续lmin，冷却，取出切片后置于PBS(PH7．2)中，TGF-Bl、VEGF、CDl05在结直肠癌中的表达及临床意义材料与方法室温下(25℃)静置20min。5．O．3％过氧化氢甲醇液，阻断内源性过氧化酶活性，室温10min。6．5％正常非免疫动物血清，室温10min。7．滴加一抗，"rGF-131、VEG

6、F及CDl05抗体，4"C冰箱过夜。PBS(PH7．2)洗5min，3次。8．滴加生物素标二抗，室温30min。PBS(PH7．2)洗5min，3次。9．滴加链霉素抗生物素蛋白．过氧化物酶(sP)液，室温下反应30min。PBS(PH7．2)洗5min，3次。10．滴加新鲜配置DAB显色液(O．04％DAB+0．03％H202),显_色，显微镜下控制，充分水洗。11．苏木素衬染2min。12．递升梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。实验设阴性对照(以PBS代替一抗)，同时用已知阳性结直肠癌标本作阳性对照。四、免疫组化阳性结果

7、判断1、TGF．B1、VEGF的阳性表达：染色细胞的胞浆呈棕黄色颗粒状，且着色明显高于背景或背景不着色而细胞着色者。记分标准参照许良中等‘121的方法：随机选择10个高倍视野共记录1000个结直肠癌细胞，并计算阳性表达细胞百分比，结合染色强度进行评分，以两者乘积为最后得分：0分为阴性㈠，l~2分为弱阳性(+)，3～4分为阳性(++)，大于4分为强阳性(卅)。见表1。表1免疫组化染色记分标准4TGF·Dl、VEGF、CDl05在结直肠癌中的表达及临床意义材料与方法2、MVD的判断：采用CDl05抗单克隆抗体标记血管内皮细胞，计数单

8、位面积中的微血管数目，即微血管密度(micro．vesseldensity,MVD)，可由此来衡量肿瘤血管的活跃程度。阳性表达主要定位于血管内皮细胞的胞质和胞膜，呈棕黄色、颗粒状。计数方法参照Weidner法[131。先在低倍镜下选取肿瘤微血管数量最丰富的区域，