北高丛越橘内生真菌分离、鉴定及次生代谢产物的研究 (1)论文

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1、北高丛越橘内生真菌的分离、鉴定及次生代谢产物的初步研究摘要内生真菌普遍存在于植物体中，其重要性正日益受到关注，内生真菌是在植物体内渡过全部或部分生活周期，而不使宿主植物表现出明显的病害症状的真菌。不同植物体内的内生真菌种类与数量也不相同，自然界中存在大量的内生真菌资源有待开发。现已有报道表明，由药用植物中分离得到的内生真菌，能够产生与其宿主植物相同或相似的化学成分。本研究选取北高丛越橘(VacciniumcorymbosumL．)为研究材料，首次进行其内生真菌资源的研究工作。并通过形态学和分子生物学方法对所分离的菌株进行了鉴定。同时对菌株H2进行

2、了次生代谢产物的分离。实验结果如下：1．采用组织块分离法，以PDA和TWA培养基为内生真菌分离培养基，在25。C下避光培养，对内生菌进行分离。实验发现以组织块印迹法对组织块表面消毒效果进行检测结果更加可靠，更灵敏。由北高丛越橘的健康叶片中分离得到54株内生真菌，其中25株内生真菌属于链格孢属(Alternaria够)，22株内生真菌属于拟盘多毛孢属(Pestalotiopsis够)，且分离率较高，分别达到46％和41％。2．对链格孢属内生真菌菌株H1和拟盘多毛孢属内生真菌菌株H2进行生长曲线的测定，结果发现两种内生真菌的生长曲线几乎都是近于“S”

3、型，在正常的培养情况下，15天左右可长满全皿。为分离提取代谢产物的最佳时期提供参考。3．运用分子生物学技术进一步对菌株H1进行了鉴定。采用CTAB法提取DNA。以ITSl和ITS4为引物，对H1的DNA进行了PCR扩增，并对扩增产物进行了测序，结果表明：这种内生真菌与已有的链格孢属真菌一豆链格孢(Alternariaazukiaein)的同源相似性达到99％。4．对菌株H2的次生代谢产物进行了分离和纯化。利用硅胶柱层析，以CHCl3：MeOH(10：1至10：10)为洗脱液，分离得到5种化学成分(C．2，C．3，C．4，C．5，C．6)。通过薄层

4、层析发现C．2和C．6与原植物叶片的乙酸乙酯部分具有相同的IU值。并对C．6进行波谱分析，经质谱、红外光谱、核磁共振谱检测和查阅文献对照，可以确定化合物C．6为倍半萜内酯类化合物，分子式为C1502H22，为我们进一步研究北高丛越橘内生真菌的次生代谢产物奠定了基础。本文的创新点：本实验采用组织分离的方法首次从北高丛越橘的健康叶片中分离到内生真菌，并确定了其优势种群为链格孢属和拟盘多毛孢属。本实验首次对北高丛越橘的内生真菌H2进行次生代谢产物的研究，并通过化学成分的初步检验，确定了化合物的分子式和结构。关键词：内生真菌，分离鉴定，PCR，次生代谢产

5、物ⅡPreliminarystudyontheisolation，identification，secondarymetabolitesofendophyticfungiofVacciniumcorymbosumLAbstractEndophyticfungiexistwidelyinthebodyofplants．Thepeoplehavebeenpayingmoreattentiontothem．Asabiggroupofmicrobeinhabitinginthelivingtissuesofplants，endophyticfungiha

6、venosignificantlynegativeeffectsonthehostplantsduringtheirwholelifehistoryorsomephases．Therearedifferentkindsandquantityofendophyticfungiindifferentplants．Itwasreportedthatendophyticfungicanproducethesameorsimilarcompoundwiththeirhost．Inthisscientificdissertation，havestudiedo

7、nresourcesofendophyticfungitowardVacciniumcorymbosumL．．Andhavebeenidentifiedthestrainsthroughthemethodsofmorphologyandmolecularbiology．ThesecondarymetabolitesofstrainH2werealsoisolatedandpurified．Theresultswereasfollows：1．Bytissuesurface-sterilized，isolationmediawerePDAandTWA

8、，andculturedat25℃intheincubator．And54strainsendophyticfungiwereisola