SNT2125-2008-李痘病毒检疫鉴定方法.pdf

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1、版权所有·禁止翻制、电子传阅、发售中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜２１２５—２００８李痘病毒检疫鉴定方法犐犱犲狀狋犻犳犻犮犪狋犻狅狀狅犳犘犾狌犿狆狅狓狏犻狉狌狊２００８０９０４发布２００９０３１６实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局版权所有·禁止翻制、电子传阅、发售标准分享网www.bzfxw.com免费下载犛犖／犜２１２５—２００８前言本标准的附录Ａ为资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国广东出入境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院动植物检疫研究所、中华人民共和国辽宁出入境检

2、验检疫局。本标准主要起草人：陈定虎、王章根、李明福、胡学难、李桂芬、王秀芬、冯黎霞、管维。本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。Ⅰ版权所有·禁止翻制、电子传阅、发售犛犖／犜２１２５—２００８李痘病毒检疫鉴定方法１范围本标准规定了李痘病毒检疫和鉴定的基本原则和方法。本标准适用于带有李痘病毒的所有进出境的无性繁殖材料、组培苗、种子和果实的检疫鉴定。２原理李痘病毒学名：Ｐｌｕｍｐｏｘｖｉｒｕｓ（ＰＰＶ），别名：Ｓｈａｒｋａｖｉｒｕｓ，是核果类果树危险性最大的病毒之一，其外壳蛋白的特异性和核酸序列的特殊性是本标准制定的主要依据；该病毒的分类地位、地理分布、寄主

3、范围和症状、传播途径、血清学特性及基因组特征等参见附录Ａ。３仪器设备、用具及试剂３．１仪器设备３．１．１酶标检测仪。３．１．２ＰＣＲ扩增仪。３．１．３电泳仪。３．１．４台式高速冷冻离心机。３．１．５凝胶成像系统。３．１．６电子分析天平。３．２用具３．２．１移液器（０．１μＬ～２μＬ，２μＬ～１０μＬ，１０μＬ～１００μＬ，１００μＬ～１０００μＬ）。３．２．２研钵。３．２．３０．２ｍＬ、０．５ｍＬ、１．５ｍＬ离心管。３．２．４酶联板。３．３犈犔犐犛犃检测试剂３．３．１包被缓冲液１０００犿犔（狆犎９．６）碳酸钠（Ｎａ）１．５９ｇ２ＣＯ３碳酸氢钠（ＮａＨＣＯ）

4、２．９３ｇ３叠氮化钠（ＮａＮ）０．２ｇ３溶于１０００ｍＬ蒸馏水中，溶液的ｐＨ为９．６，不需要调ｐＨ值。３．３．２犘犅犛缓冲液１０００犿犔（狆犎７．２～７．４）氯化钠（ＮａＣｌ）８ｇ磷酸二氢钾（ＫＨ）０．２ｇ２ＰＯ４磷酸氢二钠（Ｎａ·１２Ｈ）２．９ｇ２ＨＰＯ４２Ｏ氯化钾（ＫＣｌ）０．２ｇ叠氮化钠（ＮａＮ）０．２ｇ３用无菌水溶解并定容至１０００ｍＬ。３．３．３样品抽提缓冲液１０００犿犔二乙基碳酰二胺（ＤＩＥＣＡ）２．０ｇＰＶＰ１０２０．０ｇ１版权所有·禁止翻制、电子传阅、发售标准分享网www.bzfxw.com免费下载犛犖／犜２１２５—２００８用ＰＢＳ缓冲液

5、（ｐＨ７．２～７．４）溶解并定容至１０００ｍＬ。３．３．４洗涤缓冲液１０００犿犔吐温２００．５ｍＬＰＢＳ缓冲液５００ｍＬ无菌水５００ｍＬ叠氮化钠（ＮａＮ）０．２ｇ３３．３．５抗体稀释缓冲液１×ＰＢＳ缓冲液０．５％牛血清白蛋白（ＢＳＡ）３．３．６底物缓冲液（狆犎９．８）１０００犿犔二乙醇胺９７ｍＬ加蒸馏水８００ｍＬ叠氮化钠（ＮａＮ）０．２ｇ３用盐酸（ＨＣｌ）调ｐＨ至９．８，然后定容至１０００ｍＬ。３．３．７底物溶液在底物缓冲液中加入碱性磷酸酶的底物对硝基苯磷酸钠（狆ＮｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌＰｈｏｓｐｈａｔｅ，ｐＮＰＰ），浓度为１ｍｇ／ｍＬ。３．４犘犆犚检测

6、试剂３．４．１犚犖犃抽提缓冲液２０ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓＨＣｌ，ｐＨ８．０１ｍｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ，ｐＨ８．０１％ＳＤＳ，０．２％β巯基乙醇３．４．２犜犈缓冲液１０ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓＨＣｌ，ｐＨ８．０１ｍｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ，ｐＨ８．０３．４．３犜犃犈缓冲液４０ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓＨＡｃ１ｍｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ，ｐＨ８．０３．４．４６×加样缓冲液溴酚蓝０．２５％３．４．５引物合成根据已报道的ＰＰＶ以及其Ｄ株系和Ｍ株系的保守序列设计通用和特异性引物：ＰＰＶ通用引物：Ｐｒｉｍｅｒ１：５’ａｃｃｇａｇａｃｃａｃｔａｃａｃｔｃｃｃ３’Ｐｒｉｍｅｒ２：５’

7、ｃａｇａｃｔａｃａｇｃｃｔｃｇｃｃａｇａ３’ＰＰＶ特异性引物：Ｄ株系：Ｐｒｉｍｅｒ１：５’ａｃｃｇａｇａｃｃａｃｔａｃａｃｔｃｃｃ３’ＰＤ：５’ｃｔｔｃａａｃｇａｃａｃｃｃｇｔａｃｇｇ３’Ｍ株系：Ｐｒｉｍｅｒ１：５’ａｃｃｇａｇａｃｃａｃｔａｃａｃｔｃｃｃ３’ＰＭ：５’ｃｔｔｃａａｃａａｃｇｃｃｔｇｔｇｃｇｔ３’２版权所有·禁止翻制、电子传阅、发售犛犖／犜２１２５—２００８４检验方法４．１症状检查要仔细检查李属科植物叶片及其花、果实及种子是否有畸形、环斑、斑驳等可疑症状并采集可疑症状的样品。４．２血清学检测对采集的植物样品采用三抗夹

8、心免疫吸附测定法（ＴＡＳＥＬＩＳＡ）进行检测。ａ）采取５０ｍｇ表