SNT1127-2002-小麦印度腥黑穗病检疫鉴定方法.pdf

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1、小麦印度腥黑穗病菌检疫鉴定方法MethodsforquarantineandidentificationofTilletiaindicaMitraSN／T1127—2002前言本标准的附录A、附录B为资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国江苏出入境检验检疫局。本标准起草人：王良华、吴新华。本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。1范围本标准规定了小麦印度腥黑穗病菌检疫和鉴定方法。本标准适用于小麦和其他寄主植物种子中小麦印度腥黑穗病菌的检疫和鉴定。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准

2、的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB／T18085—2000小麦矮化腥黑穗病菌检疫鉴定方法3原理小麦印度腥黑穗病菌(TilletiaindicaMitra简称TIM，英文缩写KB)属担子菌亚门(Basidiomycotina)，冬孢菌纲(Teliomycetes)，黑粉菌目(Ustilaginales)，腥黑粉菌科(Tilletiaceae)，腥

3、黑粉菌属(Tilletia)。病原菌在麦类作物抽穗扬花期侵染种脐，在种脐的腹面呈一黑点或沿腹沟形成疱斑，为害严重时整个籽粒充满病菌的冬孢子。该病原菌的为害症状、寄主、冬孢子形态学特征、PCR反应特性等与其他腥黑粉菌不同，是鉴定该病菌的依据。4仪器、设备4.1多功能显微镜(含照相装置、摄像机及显示器)。4.2体视显微镜。4.3低速离心机。4.4往复式震荡器。4.5PCR仪。4.6凝胶电泳仪。4.7台式冷冻高速离心机。4.8低温冰箱(-70℃)。4.9普通冰箱。4.10恒温水浴锅。4.11电热干燥箱。4.12高压灭菌器。4.13普通天平(感量

4、1／100)。4.14超净工作台。4.15光照培养箱。4.16可调微量加样器(5μL～200μL)。4.17液氮罐。4.18培养皿(直径9cm)。4.19三角烧瓶(250mL)。4.20Eppendorf管。4.21刻度离心管(10mL或20mL)。4.22parafilm膜或铝铂纸。4.23载玻片(25.4mm×76.2mm，厚0.8mm～1.0mm)、盖玻片(18mm×18mm)。4.24扦样工具：扦样包、样品袋、扦样铲、长孔筛(直径20cm，孔径1.7mm×20mm)或圆孔筛(直径20cm，孔径2.5mm)、指形管。4.25白瓷盘。

5、4.26紫外分光光度计。4.27紫外灯和照相机。5药品除非另有规定，以下药品的纯度均为分析纯。5.1次氯酸钠溶液或漂白粉精片(化学纯)。5.2吐温-20(Tween-20)。5.3席尔氏浮载剂，见GB／T18085—2000附录A。5.4琼脂粉。5.5青霉素、链霉素。5.6蔗糖。5.7三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)。5.8盐酸(HCl)。5.9乙二胺四乙酸(EDTA)。5.10十二烷基磺酸钠(SDS)。5.11蛋白酶K。5.12酚。5.13三氯甲烷。5.14异戊醇。5.15氯化钠(NaCl)。5.1695％乙醇。5.17氯化钾(KCl)

6、。5.18氯化镁(MgCl2)。5.19明胶。5.20琼脂糖。5.214种脱氧核苷三磷酸(dNTP)。5.22TaqDNA聚合酶。5.23矿物油。5.24硼酸。5.25溴酚蓝。5.26溴化乙锭(EB)。5.27无荧光浸泡油(Nd=1.516)。5.28封片剂：阿拉伯树胶、指甲油或固体蜡。5.29马铃薯蔗糖培养液(PS)。6现场检疫6.1船运散装货物的原始样品的扦取和复合样品的制备船运散装小麦、黑麦草和其他小麦印度腥黑穗病菌的寄主植物种子分舱别、分层次、分品种、分等级按棋盘式选30个～50个点，以扦样铲扦取原始样品(不少于50g)并制成复合

7、样品(不少于1500g)。必要时，取样点可增至90个，复合样品的总量可增至4500g。盛放样品应使用一次性塑料袋。以其他方式进境的小麦、黑麦草和其他小麦印度腥黑穗病毒的寄主植物种子，以箱、车或其包装为单位，抽检5％件(最低不少于5件)，扦取1份复合样品，其余按本标准执行。6.1.1第一次取样卸货前在表层进行。6.1.2卸货期间取样每1000t货物扦取并制备一份复合样品。6.1.3样品登记扦取的样品必须登记。登记项目包括船名、发货港、品种、原产国及等级、舱别和层次、取样时间、样品编号、取样员姓名等。6.1.4菌瘿检查在扦取原始样品的同时，每

8、点至少另取2000g小麦，用1.7mm×20mm长孔筛或孔径2.5mm圆孔筛筛检，每筛旋转10次～20次，检查筛上物中有无可疑小麦印度腥黑穗病菌瘿，弃筛上物，留筛下物(作TCK菌瘿、昆虫、杂草