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1、GB/T5413.2-1997前言本标准参考了日本森永公司的乳清蛋白测定方法。本系列标准从实施之日起，代替GB5413-85,本标准由中国轻工总会提出。本标准由全国乳品标准化中心归口。本标准负责起草单位:哈尔滨森永乳品有限公司、国家乳制品质量监督检验中心。本标准参加起草单位:卫生部食品卫生监督检验所、浙江省轻工业研究所、雀巢(中国)投资服务有限公司。本标准主要起草人:于丽坤、张燕杰、赵勤中华人民共和国国家标准婴幼儿配方食品和乳粉Gs/T5413.2-1997乳清蛋白的测定代替GB5413-85Milkpowderandformulafoodsf
2、orinfantandyoungchildren-Determinationofwheyprotein1范围本标准规定了酪蛋白与乳清蛋白含量比率的测定方法。本标准适用于婴幼儿配方食品和乳粉中酩蛋白与乳清蛋白含量比率的测定。2方法提妥试样用SDS-聚苯烯酞胺凝胶电泳(SDS-PAGE,Laemml:法)后，用光密度计对按分子量顺序分离开的酪蛋白与乳清蛋白各谱带进行测定，求得酪蛋白与乳清蛋白的含量比率。3试荆所有试剂，如未注明规格，均指分析纯;所有实验用水，如未注明其他要求，均指三级水。3.1电泳缓冲液:将Tris(hydroxymethyl)am
3、inomethane7.5g、甘胺酸36g,SDS2.5g溶于蒸馏水中，定容至500rnL。使用前以蒸馏水稀释5倍后使用。3.2SDS试样缓冲液:0.125mol/LTrsi-盐酸(pH6.S)，体积分数20%的甘油，4%(m/V)SDS，体积分数10%2-mercaptoethanol，质量分数0.0025%的澳酚蓝(bromophnolblue).3.3染色剂:质量分数0.1%考马斯蓝R-250(CoomassiebrilliantblueR-250)，体积分数10%的甲醉，体积分数7.5%的乙酸。q月J﹃.脱色剂:体积分数10写的甲醇，体
4、积分数7.5%的乙酸。，‘JJ-酪蛋白。，心JU-精制乳清蛋白(WPC).八，j1.SDS-PAGE:用梯度凝胶(10002000)或同效凝胶。仪器常用实验室仪器及:4.1平板式电泳槽。4.2供电设备。4.3光密度计。5操作步吸5.1样液的制备将试剂按蛋白质10-20pg净L的浓度范围溶解在蒸馏水中。加入与试样同体积的SDS试样缓冲~~~~~，~阳~~~~~~，~国家技术监怪局1997一05一28批准1998一09一01实施Gs/'r5413.2-1997液，在煮沸热水中静置5min后，作为试样液。5.2标准溶液的制备使用前，酪蛋白和乳清蛋白的
5、蛋白质浓度按凯氏(Kjeldahl)法精确测定。将酪蛋白和乳清蛋白按上述方法分别进行溶解和处理后作为标准溶液。此外，还可将酩蛋白与乳清蛋白的标准溶液按蛋白质含量的任意比率(比如蛋白质的浓度比为75;25,50;50,25;75)进行混合作为混合标准溶液。5.3电泳将凝胶设置在电泳槽中，加入电泳缓冲液。试样溶液与标准溶液的添加量为每孔lOpL。电泳时间因电泳凝胶的种类不同而异。以10%-20%的梯度复合凝胶进行电泳时，定电流为40mA，时间为60min,电泳结束时间可按澳酚蓝的蓝谱带到达离凝胶下端5mm时为标志。电泳结束后将凝胶放入染色液中振荡染
6、色1h,然后转入脱色液中振荡脱色12h再移到蒸馏水中。5.4测定以光密度计对带色的各谱带进行测定，求得其颜色深度(OD)的积分值(=Trace值)。6分析结果的表述6.，谱带的测定电泳后的谱带中，参照分子量以及标准酪蛋白与乳清蛋白的电泳图，分别选择以下谱带进行计算。(1)酪蛋白:a3-酪蛋白(分子量23500),昆酩蛋白(分子量24000),‘一酪蛋白(分子量19000);(2)乳清蛋白:。一乳白蛋白(分子量14000),R-乳球蛋白(分子量18000)，血清白蛋白(分子量66000),6.2计算方法将以上三种酪蛋白谱带的Trace值合计，再除
7、以该条泳线中所有谱带的Trace值的总和，求得酪蛋白的比率(C,值)。以同样方式将以上三种乳清蛋白谱带的Trace值合计，再除以该条泳线中所有谱带Trace值的总和，求得乳清蛋白的比率(W,值)。当以酪蛋白与乳清蛋白的单独溶液为标准溶液时，按以上方法分别求得标准酪蛋白的C，值(=C=值)与标准乳清蛋白的W,值(=W，值)。将试样的C，值与W值分别除以C,值与W。值，求得暂定的酪蛋白含量比率(C:值)与乳清蛋白的含量比率(W2)。当C,值+W:值不等于1时，将C值、W2值分别除以C:值与W:值的总和进行补整，求得试样中的酪蛋白以及乳清蛋白的比率。
8、当以酪蛋白与乳清蛋白的混合溶液为标准溶液时，按以上方法分别求得各混合比率中酪蛋白的C,值与乳清蛋白的W值。将混合标准溶液的C值与酩蛋白含量比，以及W,
