鸭瘟病毒gc基因的发现、原核表达和应用的研究

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1、中文摘要鸭瘟病毒gC基因的发现、原核表达和应用研究博士研究生：徐超指导老师：汪铭书教授鸭瘟(DuckPlague，DP)，又称，鸭病毒性肠炎(DuckEnteritis)，是由∞疱疹病毒引起的鸭、鹅等雁行目动物的一种急性败血和高度接触性的传染病。相对其它疱疹病毒而言，DPV研究的总体水平较低，分子生物学所知甚少。本文对本实验室发现的鸭瘟病毒gC基因开展系列研究，获如下结果：1．鸭瘟病毒gC基因发现、克隆及分子特性分析对构建的鸭瘟病毒(DPV)DNA基因文库一个重组质粒测序，ORFFinder和BLASTN工具初步分析测序结果发现一个全长为1296bp的完整O

2、RF片段(ORFl296)。大量生物信息学分析和斑点杂交证实该ORF与其它疱疹病毒gC基因同源，与禽疱疹病毒gC亲缘关系最近，为DPV的gC基因(GenBank登录号EU076811)。其大小为1296bp，编码432个氨基酸，编码的gC蛋白的理论分子量为45kD，理论等电点(PI)为5．292。推导的gC氨基酸序列的21---24，50～58，67～70，161---171，273"--281，387"--393位最有可能为抗原表位。2．鸭瘟病毒gC基因原核表达、产物纯化及其抗体制备根据发现的鸭瘟病毒的gC基因序列，设计一对引物扩增DPVgC基因并将其克隆

3、至pMDl8-T载体，经酶切和DNA测序鉴定正确后，将DPVgC基因正向插入原核表达载体pET-32a(+)的EcoRI和船D，位点间，成功构建了重组表达质粒pET32a．gC。将重组表达质粒pET32a．gC转化表达宿主菌BL21(DE3)，经IPTG诱导、SDS-PAGE电泳分析表达出了大小约为65kD的目的重组蛋白。对pET32a．gC表达的融合蛋白Westernblot免疫印迹分析发现，该蛋白能与DPV阳性血清发生特异性反应。大量提取pET32a-gC表达产物，纯化后免疫家兔成功制备兔抗DPVgc蛋白的多克隆抗体。3．鸭瘟病毒gC基因原核表达产物免疫

4、原性研究将经纯化、复性的鸭瘟病毒gC基因原核表达蛋白与等量弗氏佐剂混合制备gC重组蛋白疫苗，免疫雏鸭研究对鸭的免疫保护效果。结果表明：一重组蛋白可以诱导机体产生中和抗体，其中和效价和弱毒组变化一致，在免疫后21d达到最高。ELISA检测的血清抗体消长规律亦同弱毒组一致。DPVgc重组蛋白对鸭瘟病毒强毒感染具有一定的保护能力。VII4．抗gC蛋白抗体介导的免疫组化和免疫荧光检测DPV建立和应用以饱和硫酸铵沉淀法结合HighQ阴离子交换柱层析纯化的兔抗DPVgC原核表达蛋白的IgG为一抗，分别建立检测石蜡切片上DPV的sP免疫组化法和间接免疫荧光双染法。应用建立

5、的两种方法研究DPV-CHv强毒株人工感染雏鸭肝、肺、肾、脑、十二指肠、空肠、回肠、直肠、法式囊、脾脏、腺胃、食道等组织中DPV病毒定殖、动态变化规律和gC蛋白在各组织中表达时相。结果表明：DPV是一种泛嗜性的病毒，SP法和免疫荧光法均可特异检测到DPV感染鸭肝、肺、肾、脑、十二指肠、空肠、回肠、直肠、法式囊、脾脏、腺胃、食道中DPV抗原的存在。人工感染8h即可在十二指肠、空肠、回肠和直肠中检测到DPVgC的表达；攻毒12h时，肝、食道、腺胃可检测到病毒gc表达蛋白；24h可在法式囊、肾和脾脏可检测到gc表达蛋白：2d在肺、大脑检测到gC表达蛋白：3d到死亡

6、鸭各组织器官均可持续检测到gc表达蛋白存在。5．抗gC蛋白抗体介导的抗原捕获ELISA检测DPV建立和应用以兔抗DPVgC基因原核表达蛋白为第一抗体，以纯化的兔抗DPVIgG为夹心抗体，建章并优化了检测DPV的抗原捕获ELISA方法。结果表明：gC重组蛋白的最佳包被浓度为1．6／．tg／孑L，检测血清的最佳稀释度为1：80，酶标二抗的最佳稀释度是l：1000。本方法敏感、特异、稳定，可应用于临床病料DPV病毒的快速、批量诊断。6．DPVgC蛋白作为包被抗原检测鸭瘟抗体间接ELISA建立和应用以纯化的DPVgC表达蛋白作为包被抗原初步建立了检测鸭瘟抗体水平的间

7、接ELISA法(gC-ELISA)，并对该方法进行了标准化研究。用本法(gC-ELISA)和本实验室研制DPV抗体检测试剂盒平行检测56份送检血清，符合率为94％，表明建立的gCELISA检测方法具有很好的特异性和敏感性，可以用于DPV感染的诊断和疫苗免疫后的抗体监测。7．基于DPVgc基因的PCR检测方法建立和应用根据发现的DPVgC基因序列，建立检测DPV的PCR方法。特异性试验表明，设计引物对正常DEF细胞、鸭胚尿囊液及鸭肝炎病毒、鸭乙型肝炎病毒、小鹅瘟病毒、鸭巴氏杆菌、鸭大肠杆菌、鸭疫里默氏杆菌的核酸提取物进行的PCR的结果为阴性；而对DPV基因组D

8、NA，其灵敏度可达到lpg：应用该PCR方法对DPV