肠道病毒71型分子流行病学调查与mirna抑制肠道病毒71型体外复制的的研究

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1、独创性声明⋯Iilll11111IlllL]llltllllllllllllY1895496本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下独立完成的，除文中注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体的研究成果。对本论文做出重要贡献的个人和集体，均在文中作了声明并表示谢意。作者签名：等波细学位论文版权授予书本学位论文作者同意学校保留该学位论文并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权江苏大学可以将本学位论文的全部内容或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制

2、手段保存和汇编本学位论文。本学位论文属于保密口，在年解密后适用本授权书。不保密田。导师签签字日期：∥lf．‘-丙类传染病之首，对我国人民的卫生健康造成了严重威胁，今后一段时间疫情可能进一步上升，防控形势十分严峻。手足口病(Hand，footandmouthdisease，HFMD)是由小RNA病毒科的多种肠道病毒引起的传染病，主要有：柯萨奇病毒A组的4、5、7、9、10、16型；柯萨奇病毒B组的2、5型；肠道病毒71型以及埃可病毒，其中以柯萨奇病毒A16型(CoxAl6)和肠道病毒71型(EV71)最常见。一般来说，手足口病

3、的症状轻微，约在10．14天左右自愈。但EV71引起的手足口病有时引起神经系统症状，甚至导致死亡。目的：本研究拟建立针对手足口病和EV71的快速检测方法，持续监测手足口病；调查了解镇江市手足口病的流行病学特点，在手足口病的高发时段和高发人群加强防控；研究了解江苏省EV71的基因特征，以便更好的了解EV71病毒的起源地、变异规律和流行途径，防范EV71的大规模流行。目前，针对EV71的感染尚无特异性的预防疫苗、治疗方法和抗病毒药物。因此，尚需深入研究EV71的致病机制，尤其是EV71引发重症感染的机制。本研究利用肠道病毒易感细

4、胞RD细胞分离EV71病毒株，将EV71感染SKoN．SH神经细胞后，利用miRNA芯片比较神经细胞感染EV71前后miRNA的变化，筛选出差异表达的miRNA。寻找并验证miRNA对EV71病毒感染神经细胞的干预作用，为今后利用miRNA治疗EV71感染提供理论和实验基础。方法：(1)手足口病通用病原和肠道病毒71型检测方法的建立利用TaqMan．LNA探针建立多重荧光定量RT-PCR方法，同时检测肠道病毒71型(EV71)和肠道病毒通用型(EV-U)，使用含有目的序列RNA标准品制备标准曲线，对病毒进行准确定量，同时对该

5、方法的特异性、灵敏度、重复性进行评估，并对临床样品进行检测。肠道病毒71型分子流行病学调查及miRNA抑制肠道病毒71型体外复制的研究(2)镇江市2009．2010年手足口病的流行病学调查以镇江市2009年1月1日．2010年12月31日诊断为手足口病的9899例患者(按发病日期统计)为研究对象，采用描述性流行病学方法对本市手足口病的流行特征进行分析。(3)江苏省肠道病毒71型分子流行病学调查采集临床手足口病(HFMD)患者咽拭子标本，抽提病毒RNA，通过巢式PCR扩增肠道病毒71型vpl基因的核苷酸序列。利用Clustal

6、X和MEGA5．0分析软件，进行同源性分析并构建系统发生树。(4)肠道病毒71型感染神经细胞后miRNA的变化利用RD细胞分离EV71病毒，将EV71感染SK。N．SH神经细胞，分别提取EV71感染SK．N．SH神经细胞前后的RNA，利用miRNA芯片筛选EV71感染SK-N．SH神经细胞前后表达差异的miRNA。选择部分表达差异和无差异的代表性miRNA，进行实时荧光定量PCR，验证miRNA芯片的分析结果。(5)miRNA对EV71复制的调控选取EV71感染SK-N．SH神经细胞前后表达差异显著的miRNA，合成miRN

7、A模拟体和抑制体，转染SK-N．SH神经细胞后，与空白、阴性对照组同时感染EV71，通过观察细胞病变效应(CPE)、WesternBlot、实时荧光定量PCR比较EV71的复制情况，分析miRNA对EV71复制的调控。结果：(1)本研究建立了基于TaqMan．LNA探针的多重荧光定量RT-PCR方法，能同时定量检测肠道病毒71型(EV71)和肠道病毒通用型(EV-U)，该法特异性为100％，灵敏度达到102拷贝／止，重复性好。(2)镇江市2009．2010年报告儿童手足口病全年散发，手足口病的发病病例主要有两个高峰期，一个主

8、要的高峰期集中在4、5、6月份，三个月报告病例占全年疫情总数的56．2％。另一个较小的高峰期出现在11到12月，两个月报告病例占全年疫情总数的17．4％。镇江市发病人群以1．3周岁儿童为主，3岁及以下病例占总病例数的69．22％。职业分布以散居儿童和幼托儿童为主，占总病例数的95．6％，且