海洋双壳类动物金属硫蛋白的提取与分析技术研究

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1、海洋双壳类动物金属硫蛋白的提取与分析技术研究学位论文完成日期：指导教师签字：答辩委员会成员签字：独创声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含未获得(洼!翅遗查基丝益蔓挂别直盟的!奎拦亘窒2或其他教育机构的学位或证书使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：肖舒签字日期：州务年‘月刈日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关部门或

2、机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同时授权中国科学技术信息研究所将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》，并通过网络向社会公众提供信息服务。(保密的学位论文在解密后适用本授权书)学位论文作者签名：j

3、i甭多签字日期：∞p年‘月-1日翩擀＼雄专海洋双壳类动物金属硫蛋白的提取与分析技术研究摘要金属硫蛋白(metallothioneins，MTs)是一类低分子量、富含半胱氨酸的金属结合蛋白。由于水生生物体的MTs能被金属诱导，而且诱导程度与水环境重金属浓度

4、之间存在一定的相关性，可间接反映出水环境中重金属的污染水平，因此，海洋动物体内的MTS已被认为是海水和沉积物重金属污染的生物标志物。而且海洋动物MTs含量还被认为是海洋金属暴露风险评价和健康评价的重要工具。近二十年来，为了将MTs应用于海洋污染的生物监测，国内外学者先后研究了多种分析技术及相应的提取方法。但是海洋动物MTs的分离和定量分析尚无国际性的标准方法，因此本研究以暴露于含镉海水的菲律宾蛤仔(Ruditapesphilippinarum)为试验材料，在文献报道的汞饱和法和分光光度法的基础上，分别对两种方法的提取和测定条件进行优化。对汞饱和法的优化，依次采用正交设计和单因素设计对内脏

5、和鳃MT(以粗提液中的巯基含量表示)的提取工艺条件进行优化。所得到的内脏最佳匀浆条件为：Tris．HCl缓冲液浓度为0．02mol／L，pH值7．8，内脏与缓冲液的质量体积EL(rn／v)为1／5，其中，缓冲液的浓度对提取效果影响较大。最佳除杂条件为：匀浆液首先在4"C、200009离心30min，再于80。C水浴加热10rain，然后于4"C150009离心10min。所得到的鳃最佳匀浆条件为：Tris．HCl缓冲液浓度为0．02mol／L，pH值7．8，内脏与缓冲液的质量体积比(m／v)为1／4，其中，缓冲液的pH对提取效果影响较大。最佳除杂条件为：匀浆液首先在4℃、250009离心

6、20min，再于80℃水浴加热10min，然后于4℃150009离心10min。测定条件优化时，以菲律宾蛤仔的鳃组织为试验材料，逐一测定该方法的各因素对鳃组织Cd．MT提取液中汞含量的影响，由此得到汞饱和法测定双壳类MT的适宜条件为：将稀释4倍的Cd-MT提取液与H矿+浓度50mg／L的10％Z．氯乙酸按等体积比混合后，孵化反应5min，再加入1．5倍体积的2％牛血红素溶液，迅速在200009离心20rain。经过优化的汞饱和法对蛤仔Cd．MT的相对标准偏差为4．95％，加标回收率为71．080／o---78．86％，检出限为0．24pgHg／L，对应于4．471xgMT／g组织。对于分

7、光光度法的优化，采用单因素设计分别对内脏和鳃MT(以粗提液中的巯基含量表示)的除杂工艺和测定条件进行优化。内脏除杂最佳工艺条件为：取lml上清液加入lml无水乙醇(．20。C预冷)和809l氯仿，离心取上清液加入3倍体积无水乙醇．20℃沉淀lh，60009离心10rain后弃去上清液，取沉淀加1．74ml无水乙醇和260plTris．HCl(含蔗糖)振荡冲洗沉淀，离心取沉淀，N2吹干得到MT干粉。最佳测定条件为：Ellman显色试剂中NaCI浓度为0．5mol／L。经优化的分光光度法测定内脏MT相对标准偏差为3．20％，加标回收率在90．09～96．85％之间，检测限9．98pgMT／g

8、组织。鳃MT除杂阶段最佳工艺条件：取lml上清液加入lml无水乙醇(．20℃预冷)和40山氯仿，离心取上清液加入3倍体积无水乙醇．20℃沉淀lh，60009离心10rain后弃去上清液，N2吹干得到MT干粉。最佳测定条件：Ellman显色试剂中不含NaCl。经优化的分光光度法测定鳃MT相对标准偏差为2．92％，加标回收率在91．88～101．29％之间，检测限6．61I．tgMT／g组织。综上所述，相对于汞饱和法，分光光度法简单、重