锥虫亚属种间进化和分子鉴定及ssao介导锥虫致死作用

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1、中山大学博士学位论文李风军锥虫亚属种间进化和分子鉴定及SSAO介导的锥虫致死作用专业：动物学博士生：李风军指导教师：伦照荣教授摘要锥虫亚属三个种：布氏锥虫、伊氏锥虫和马媾疫锥虫分别引起家畜的那加那病、苏拉病和媾疫病，给疫区国家造成巨大的经济损失，是家畜业最重要的寄生虫病之一。关于伊氏锥虫和马媾疫锥虫的起源以及锥虫亚属三个种之间的进化关系还存在众多争议。本论文采用MGE一，SSR一和RAPD—PCR=种分子标记技术研究了分离自中国、非洲和南美洲的18个锥虫虫株(包括5株布氏锥虫、10株伊氏锥虫和3株马媾疫锥虫)之间的遗传相似性。利用三种分子标记技术，在所有18个虫株中共获得890多条典型条

2、带片段，片段大小介于0．2kb至1]2kb之间，每个虫株获得的典型条带数介于39条至1J59条之间。每两虫株之间的遗传相似系数(sc)从～41％到～94％不等，平均相似系数为一65％，同布氏锥虫和马媾疫锥虫相比，伊氏锥虫内部的遗传相似度最高，平均遗传相似系数为一79％，而前两者分别为一59％和一65％。根据各虫株之间的遗传相似系数构建系统发生树，结果显示，如果不考虑种的因素，绝大多数分离自中国和南美洲的虫株聚类于同一个进化枝，而几乎所有来自非洲的虫株单独成簇(除布氏锥虫AnTat2．1株外)，因此，尽管伊氏锥虫和布氏锥虫有各自单独成簇的趋势，利用该三种分子标记并不能明确区分三种锥虫。研究

3、结果支持伊氏锥虫和马媾疫锥虫均源自变异的布氏锥虫，而伊氏锥虫源于马媾疫锥虫突变株的假说。此外，本论文还探讨了地理因素对锥虫亚属内各种间进化的影响。迄今为止，锥虫亚属三个种之间的分子鉴别还是一个难题，给从事该领域研究的寄生虫学家造成很大的困惑，而该三种锥虫最为明显的分子差别应为动基体DNA(包括大环和小环)的差异。本论文的另一个研究目的是根据布氏锥虫动基体大环DNA序列设计特异的PcR引物反应来鉴别布氏锥虫、伊氏锥虫和马媾疫锥虫并评估其在野外诊断中的潜在应用价值。我们根据布氏锥虫动基体大环中山大学博士学位论文李风军DNANADH脱氢酶亚单位5(ND5)设计的引物对9株布氏锥虫(包括7株指名

4、亚种和2株罗得西亚亚种)、10株伊氏锥虫、5株马媾疫锥虫、2株活泼锥虫及1株刚果锥虫进行了PCR扩增，同时采用锥虫亚属特异的TBR．PCR作为锥虫基因组质控标准，结果表明从所有布氏锥虫和马媾疫锥虫虫株中都可以扩增出-395bp的目标片段，而所有伊氏锥虫、活泼锥虫、刚果锥虫及宿主DNA均显示阴性结果。利用该PCR方法可以快速将布氏锥虫和马媾疫锥虫从伊氏锥虫中区分开来，其检测灵敏度为20．25条虫／PCR反应(用基因组DNA或处理过的感染锥虫的血液样品)。在此基础上，我们分析了该方法的可靠性，并探讨了动基体DNA差异在锥虫亚属种间进化上的反映。氨基脲敏感的胺氧化酶(SSAO)广泛分布于血管平

5、滑肌细胞膜、脂肪细胞以及血液中，该酶介导其内源性底物甲胺的脱氨基作用，产生甲醛和过氧化氢。近来的研究表明体内SSAO的含量同一系列疾病(如糖尿病、心血管疾病、阿尔茨默氏病)密切相关，因此对其研究越来越受重视。在本论文中我们检测了人脐带动脉粗提物、山羊血清、兔血清、胎牛血清和小鼠血清中的SSAO活性，并分析了它们介导的甲胺脱氨基作用对布氏锥虫的细胞毒影响，结果表明该酶在其底物甲胺浓度高于10’4M时对培养的锥虫具有明显的细胞毒性，该毒性作用可以被SSAO的抑制剂氨基脲或MDL-72974A消除，因此我们认为该毒性作用是由SSAO介导的甲胺脱氨基所产生的甲醛和过氧化氢导致的，而我们的实验也表

6、明甲醛和过氧化氢对锥虫的生长具有明显毒性，其半数致死浓度均为～10。5M，这是SSAO介导杀锥虫甚至其他微生物的主要机制。此外我们分析发现山羊、兔、牛和小鼠四种动物血清中SSAO活性与锥虫感染虫血症水平之间密切相关，因此，我们认为“SSAO一甲胺系统”是宿主对抗锥虫感染的一种固有免疫系统，这是在动物中新发现的一种先天免疫机制。关键词：锥虫亚属；布氏锥虫；马媾疫锥虫：伊氏锥虫；遗传进化；分子鉴定SSAO；细胞毒；固有免疫II中山大学博士学位论文李风军GeneticrelationshipsandmoleculardifferentiationofsubgenusTrypanozoonspe

7、ciesandSSAOmediatedcytntoxicitytoTrypanosomabruceiinvitroMajor：ZoologyName：Feng-JunLiSupervisor：ProLZhao—RonghnABSTRACTThesubgenusTrypanozoonincludesthreespecies，namelyTrypanosomabrucei，ZevansiandZequiperdumwhichcauseN