高效液相色谱化学发光分析研究

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1、摘要皇曼曼!曼詈曼曼曼詈鲁詈曼曼曼曼鲁鲁皇曼曼,——-I一_曼量鼍皇量葛葛詈暑鼍曼詈鼍曼鼍曼詈曼量皇皇曼!曼高效液相色谱．化学发光分析研究分析化学专业博士研究生陈福南指导教师章竹君教授摘要化学发光(chemiluminescence，eL)是在没有光、电、磁、声、热源激发的情况下，由化学反应或生物化学反应产生的一种光辐射。以此为基础的化学发光分析，由于可以进行发射光子计量，又没有外来激发光源存在时散射光背景的干扰，因而具有很高的灵敏度(检出限可达lfflLIO-2Jm01)，很宽的线性范围(3-6个数量级)，同时仪器设备又很简单

2、、廉价、易微型化，在近三十年发展非常迅速．然而，化学发光分析法的一个突出的缺点是选择性比较差，严重制约了它的应用。人们采用了多种方法来弥补化学发光分析的这个缺陷，一是与特异性分子识别反应联用，如酶反应，包括纯酶反应、动植物组织或细胞；抗原一抗体反应或受体．配体反应：核酸、适配体、DNA、RNA等特异性识别及分子印迹聚合物识别等。另一种方法是将化学发光分析同高效分离方法相结合，姐高效液相色谱，毛细管电泳和凝胶电泳等。高效液相色谱∞ighPerformanceLiquidChromatography，HPLC)是一种具有高效、快速及

3、应用广泛的现代分离技术。具有分离效率高、选择性好、分析速度快、操作自动化、应用范围广的特点，已经成为有机物质分析的支柱技术，在生物化学、临床医学、食品检验、石油化工及环境污染监测等领域得到广泛的应用。对HPLC的研究主要集中在三个方面：一是研究各种类型的色谱柱：二是研究与HPLC耦合的检测器：三是研究如何拓宽HPLC的应用范围。检测器作为HPLC系统的重要组成部分，充当着“眼睛”的角色．人们已经研究和开发了多种检测器。如紫外．可见光检测器(or·vls)、光电二极管阵列检测器(PDA)、荧光检测器(FLD)、示差折光检测器(RJ

4、D)、电化学检测器(ECD)、蒸发激光散射检测器(ELsD)，光电导检测--器(PCD)、磁旋光检测器(MDR)、放射性检测器(RD)、热离子化检测器(TID)、化学发光检测器(CLD)和质谱(MS)捡测器等。往众多的HPLC检测器当中．化学发光检测器结构简西南大学博士学位论文量!曼暑I．笪曼曼皇曼曼皇舅一蔓蔓一_一

5、11曼曼曼曼曼曼皇曼曼曼皇曹曼皇曼!皇曼皇曼皇曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼单，背景低，灵敏度高，被越来越多地应用于各种复杂样品中Pg或龟级含量化合物的检测。与紫外检测器、荧光检测器等常用的检测器不同，化学发光检测

6、器不是一种通用的检测器，某些共存物质即使不能通过色谱柱很好分离，也会因为其中一些物质不能发生化学发光，或者产生化学发光的条件不同而被区分开来，这就可以避免了在紫外检测等方法里不可避免的干扰。因此化学发光检测器与HPLC联用成为当今化学发光分析分析研究及应用非常活跃的热点之一。HPLC．CL联用技术从理论上结合了二者的优势，可以实现高灵敏度、高选择性的快速分离分析。实际应用中仍然存在两个主要问题：1)由于化学发光检测器需要在检测池中进行化学发光反应，反应试剂溶液的加入会出现稀释效应并导致色谱峰展宽，使HPLC分离度降低。2)色谱分

7、离条件与化学发光反应条件不一致，因而不是所有的化学发光体系都适合用作色谱柱后检测器。围绕这两个问题，本研究设计了一种新的化学发光检测池，将分离柱后的毛细导管直接插入流动的和不断更新的化学发光试剂环形池中，由于所建立的化学发光反应是一种快速化‘学发光反应。从柱后流出的各分离组分能立即在检测池中产生化学发光反应并立刻被窗口检‘测到。这样设计的检测池无任何死体积和稀释效应存在，与传统的化学发光检测器比较，获得的色谱峰比较窄，从而提高了分离度。通过在完成反应池设计、柱后接口、优化色谱分离和化学发光检测器条件的基础上，提出了一系列灵敏度高

8、、选择性好的HPLC．CL检测新方法，并将这些新的高效液相色谱-化学发光检测方法应用于生物样品如人体血液和尿液中某些痕量药物的检测。结合微透析技术还实现了活体、在线、实时药物代谢动力学研究。活体动态生化分析是近年来在分析化学领域迅速发展起来的新的研究领域。其中微透析技术占重要地位。微透析技术是一种新型的生物采样技术，在药物代谢动力学领域，尤其是在药物分布与代谢的研究方面发挥着日益重要的作用。传统的药代动力学研究都是采用脱线分析，不能完全真实反应组分在动物体内的分布和代谢情况。而微透析取样方法对组织损伤小，可以在基本上不破坏生物体

9、内环境的前提下对细胞间液中小分子物质进行连续取样。当采用在线分析时，还可以使被透析出的物质在接近体内环境的条件下得到检测。可以实时的监测到体内多种化合物量随时间的变化。取样无需匀浆过程，可真实代表取样位点目标化合物的浓度，同时在体内不同部位插入微透析探针可研究目