rnai抑制g250基因以与对肾癌7860细胞生物学特性影响的实验的研究

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1、博士学位论文RNAi抑制G250基因以及对肾癌786-0细胞生物学特性影响的实验研究博士研究生：赵俊峰指导导师：郑少斌教授摘要研究背景与目的肾癌(又称肾细胞癌，renalcellcarcinoma，简称RCC)是最常见的成人泌尿系统恶性肿瘤。根据统计，2006年美国新发肾癌病例38890例，其中12840例死亡，占所有新发实体肿瘤的2％。20％的患者在初次就诊时就有转移，而肾癌根治术后也有50％的患者会出现转移。肾细胞癌一旦有转移，预后不良，5年生存率<10％，平均存活时间不到2年。国内虽然缺乏确切的统计数据

2、，但是其发病率居泌尿系统恶性肿瘤的第二位，而且呈逐年上升的趋势。肾癌的发病机制及发生发展的分子生物学基础至今仍不清楚。以往的研究表明，肾癌的发生发展与VonHippel—Lindau(vHL)、野生型p53等抑癌基因的失活及Wnt、突变型p53、C-myc、CD44v6等原癌基因的异常表达有关，缺氧诱导因子(hypoxia-induciblefactor，HIF)、T细胞因子／淋巴增强因子(TCF／LEF)家族、p-catenin(p一连环蛋白)等亦参与其中。而一些研究表明，一种肾癌肿瘤相关抗原(tumor-

3、associatedantigen，T从)G250与肾癌的发病关系密切。根据目前国外的研究，G250被认为是一种肾细胞癌肿瘤相关抗原(T从)，在约98％的肾癌原发灶有G250抗原表达，尤其是透明细胞癌全部有表达，88％的转移灶有该抗原表达，而在正常组织中，仅限于胃黏膜和大胆管上皮细胞有少量表达。同期的研究发现G250与碳酸酐酶家族的异构酶心／CAⅨ基因是相同的。G250基因位于9p12-13，人类G250基因共含有10898个碱基，包括11个外显子，10个内含子。中文摘要随着对G250的研究不断深入以及其显示

4、出来的良好的肿瘤特异性，其在肾癌的诊断、筛选以及生物治疗方面具有非常好的应用前景。比如G250单克隆抗体(G250mAb)可以直接攻击表达G250蛋白的肾癌细胞，肾癌细胞表面的G250抗原可以增强抗体依赖的细胞介导的细胞毒反应(antibody—dependentcell-mediatedcytotoxicity，ADCC)，利用核素标记的G250mAb进行肿瘤放射免疫显像、放射免疫治疗以及利用G250的特异性和免疫原性进行肿瘤疫苗的研究等。而最近的研究发现G250可能是一种癌基因，与肾癌的发生、发展有关，在

5、肾癌的发生、发展中具有不可忽视的作用，所以有必要对G250在肾癌的发生、发展中的真正作用进一步认识，并在此基础之上，开展肾癌诊断和治疗方面的研究。RNA干扰技术是近年来发展起来的新的生物工程技术。人工诱导RNA干扰技术的建立，为基因功能研究和人类基因治疗开辟了一个全新的领域，取得了令人振奋的研究成果。利用人工诱导RNA干扰技术使所研究的目的基因沉默从而进一步研究目的细胞的生物学特性及功能是目前分子生物学领域常用的实验方法。应用该技术使G250基因沉默，观察肾癌细胞生物学特性的变化，来研究G250基因对肾癌的发

6、生、发展的影响，该方法简便、易行，结果可靠，目前国内外尚无类似研究报道。本研究旨在探讨能否在肾癌细胞系中利用人工诱导RNA干扰技术，抑制G250基因表达，通过体内、外试验研究G250基因沉默对肾癌细胞系786-0细胞生物学特性的影响，进而了解G250基因对肾癌的发生及发展的影响，为阐明肾癌的发生机制提供理论依据并为进一步探索肾癌的基因治疗奠定基础。方法第一章G250基因特异性siRNA的设计、合成及表达载体的构建和鉴定利用NCBI的基因库(GcneBank)及计算机辅助设计软件设计4条内含不同G250基因特异

7、性序列的寡核苷酸干扰片断(命名G250siRNA．1～G250siRNA4)，并设计另一条无意义序列(命名G250siRNA．n)作对照，寡核苷酸链退火后用T4DNA连接酶连接到线性化的pRNAT-U6．1／Neo载体中，构建成重组质粒载体H博士学位论文pshRNA．G250进行酶切及序列鉴定。第二章siRNA表达载体抑制肾癌786．0细胞G250基因的实验研究利用阳离子脂质体LipofectainerM2000将pshRNA-G250导入肾癌细胞株786．0细胞中，用空质粒载体做空白对照，经G-418筛选获

8、得抗性单克隆，挑取荧光强的克隆进行扩大培养，荧光定量RT-PCR和Westernblot鉴定干扰后各组G250mliNA和G250蛋白在肾癌786-0细胞中的表达；挑选干扰效果高的克隆进行后续的RNA干扰实验。第三章(3250基因沉默后对肾癌786．0细胞生物学特性影响的实验研究利用MTT法观察转染重组质粒后的4组肾癌786-0细胞(高干扰效率2组为si．G250．a、si．G250．b，干扰阴性对