静电纺聚合物超细纤维作为基因控释体系的研究

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1、西南交通大学硕士研究生学位论文第1页摘要电纺纤维技术作为一种新型的材料加工方法，可以得到直径在纳米到微米级的超细纤维膜。纤维膜具有较高的孔隙率、极大的比表面积、良好的结构仿生性，有利于细胞的粘附和药物的携载和释放。本论文旨在构建一种新型携载基因的聚合物超细纤维制剂，系统研究基因的携载和释放，电纺和释放过程中基因的结构完整性和转染活性的保持等。本文首先是模型基因的提取和纯化。通过CaCl2法制备E．coliDH5a的感受细胞，将pECFP．N2质粒转化感受细胞，构建了含pECFP．N2质粒的E．coliDH5a转化子。经大量培养扩增后，利

2、用试剂盒提取纯化pECFP．N2质粒。经过紫外光谱、凝胶电泳检测，得到的质粒与原质粒结构相符、纯度较高。采用乳液电纺的方法，成功地将质粒DNA载到聚乳酸．聚乙二醇共聚物(PELA)中，得到DNA／PELA纤维。纤维形貌规整，直径为450±140nnl，激光共聚焦扫描电镜观察表明荧光标记质粒包裹于纤维内部，形成了明显的核壳结构。质粒的实际包裹效率达到了92．7％，从纤维中萃取的质粒经琼脂糖凝胶电泳检测表明结构完整，细胞转染实验表明质粒活性良好，表明电纺过程较好地保护了质粒的结构和活性。体外释放显示出一个缓慢、稳定的释放特性，在12h仅释放

3、了29．1％，维持了将近35天的缓慢释放，表明了核壳结构的纤维在减少突释、保持持续释放等方面的作用。电泳检测结果表明核壳纤维在释放过程中保持了完整的结构，细胞转染实验证明了保持了较好的转染效率，这进一步证明了核壳结构纤维对质粒的保护作用。在乳液电纺中，分别在油相和水相中引入聚乙烯亚胺(PEI)，制备了D蝴ELA．PEI和DNA-PEI／PELA核壳结构纤维。体外释放结果表明，DNA／PELA．PEI和DNA／PELA纤维的释放行为相近，都能很好地控制DNA的释放。但DNA．PEI／PELA除了早期的突释外，DNA．PEI复合粒f难于释放

4、出来。西南交通大学硕士研究生学位论文第1I页在细胞的粘附和增殖试验中，DNA／PELA．PEI纤维中PEI的加入一定程度上改变了纤维的亲水性，但是随着其含量的增加也加大了对细胞的毒性。而DNA-PEI／PELA纤维中，复合粒子的突释导致培养初期对细胞的毒性。在纤维支架上的细胞转染实验结果表明，在纤维核层或壳层中引入PEI有助于质粒对细胞的转染，转染效率与加入的PEI量有关。本文利用乳液电纺成功将质粒载到核壳结构的超细纤维中，在电纺和释放过程中较好地保持了基因的结构完整性和转染活性。本研究不但对药物控释体系和组织工程的研究有一定的借鉴意义

5、，也为基因治疗提供了新的思路。关键词：质粒；静电纺丝；药物释放；核壳结构：结构完整性；转染活性西南交通大学硕士研究生学位论文第1Il页AbstractElectrospinningtechnologyasanoveltypeofmaterialsprocessingmethod，hasmanyexcellences，suchasrelativeeaseofuse，adaptability，andtheabilitytofabricatefiberswithdiametersonthenanometertomicrometerscale．

6、Furthermore，theelectrospinningprocessaffordstheopportunitytoengineerscaffoldswithmicrotonanoscaletopographyandhighporositysimilartothenaturalextracellularmatrix．Theinherentlyhighsurfacetovolumeratioofelectrospunscaffoldscanenhancecellattachmentanddrugloading．Inthecurrent

7、study，elcctrospunultrafinefiberswereinvestigatedascarriersofplasmidDNA,andtheloadingefficiencyandsustainedreleasebehaviors，thestructuralintergrityandtransfectionefficacyofentrappedDNAwereexaminedindetail．ThecompetentEscherichiacolibacteriacellswereobtainedbyCaCl2method．p

8、EGFP-N2(4737bp)encodinggreenfluorescentprotein(GFP)Wasamplifiedinatransformantofcompetentbacteriaandiso