e1a激活基因阻遏子调控体外培养人血管平滑肌细胞表型转化

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1、独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得大连医科大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：南袋抄豫签字日期：三丛年』月卫日学位论文版权使用授权书本学位论文作者及指导教师完全了解大连医科大学有关保留、使用学位论文的规定，同意大连医科大学保留并向国家有关部门或机构送

2、交学位论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权大连医科大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。论文作者签名：鲨!：塑指导教师签名：丝)!竺签字日期：坦年』月兰日E1A激活基因阻遏子调控体外培养人血管平滑肌细胞表型转化硕士生姓名：指导教师：指导小组：专业名称：徐红梅韩雅玲教授康建副主任技师闫承慧主管技师内科学摘要研究背景及目的成熟血管壁的血管平滑肌细胞(vascularsmoothfnuscleceHs，VSMCs)具有极大

3、的可塑性，正常血管壁的VSMCs处于分化表型，当血管损伤后VSMCs可发生表型逆转，由分化表型(收缩表型)转变为去分化表型(合成表型)，并获得增殖、迁移及合成、分泌大量细胞外基质的能力。VSMCs细胞增殖、细胞外基质异常累积以及同时伴有的大量细胞凋亡是经皮冠状动脉介入治疗(perctlt蹰eouscofonar譬inte“ention，PCI)术后血管再狭窄(restenosis，RS)及动脉粥样硬化。(atIleroscle∞sis，AS)等病理过程中内膜增生的主要原因。其中VSMCs由收缩表型向合成表型

4、的转化是其发生发展的关键始动步骤，也是内膜增生的病理基础。同时伴发的vSMCs过度凋亡则是VSMCs由分化表型向去分化表型转化的一个重要病理特征，其发生机制与vSMCs的异常增殖及成熟抑制状态密切相关。因此，阐明vSMQ表型转化的机制对RS和AS的防治至关重要。人E1A激活基因阻遏子(cellulaf榔re880rofElA．stiHmlatedgenes，CREG)是本研究室应用差异显示PCR技术在体外培养的分化表型人VSMCs克隆株HITASY细胞中筛选到的高表达差异性基因。进一步系列研究发现，CREG

5、基因表达与HrrASY细胞的分化状态密切相关，即去血清培养诱导HITASY细胞由合成表型逆转为分化表型的过程中伴有CREGmRNA和蛋白表达上调。a强G可以与血清反应因子(semmresponsefactor，sRF)协同作用于平滑肌c【一肌动蛋白(smoothmusc】e*actin，SMo【一actin)启动予区的cArG元件从而启动sM0【一actin的表达，参与体外培养的大鼠原代vsMcs表型转化的调控。大鼠颈动脉拉伤实验证实，cREG蛋白表达与血管损伤后Rs过程中平滑肌细胞增殖能力呈负相关。提示C

6、REG基因具有促进分化、抑制增殖等使vSMcs向分化表型转化的功能。因此，本研究初步探讨CREG基因调控人vSMCs表型转化的分子机制。实验方法(1)以带绿色荧光蛋白(greennuorescentprotein，GFP)的空载体pLNCX(+)／GFP为对照，用磷酸钙共沉淀法将正义cREG逆转录病毒表达载体【pL，NCx2(+yCREG]、反义C砌Ⅺ逆转录病毒表达载体【pLXsN(一)／CREG】及pLNCx(+)／GFP感染293细胞，包装出完整的逆转录病毒后，感染HITASY细胞，经G418筛选，获得

7、稳定感染的细胞克隆。(2)应用免疫荧光染色、westemblot等方法检测感染前后HITAsY细胞中CREG蛋白和平滑肌分化标志蛋白SMa—actin的表达和定位。(3)应用倒置相差显微镜观察感染前后HITAsY细胞的形态学改变。(4)应用westemblot法检测感染前后CREG蛋白对SM，静ac畦n相关调控因子一RhoA表达的调控。(5)应用免疫荧光染色，总蛋白、核蛋白及浆蛋白的westemblot等方法检测感染前后CREG蛋白对SM旺一actin相关调控因子一SRF的表达和定位的调控。(6)以Rho激

8、酶特异性抑制剂Y．27632作用pL，NCx2(十)／CREG细胞后，Westemblot法分析SM0【．actin的表达及SRF的核转位。(7)应用免疫共沉淀分析感染前后细胞无血清培养基中cREG蛋白的分泌表达及CI砸G与6。磷酸甘露醇胰岛素样生长因子11受体(insulin．1ikegrowt}l住ctorII，mannose6一phosphatercceptor，M6P，IGF2R)的相互作用关系。(8)以