甲型肝炎乙型肝炎戊型肝炎三联疫苗的免疫原性的研究

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1、中文摘要甲型肝炎．乙型肝炎．戊型肝炎三联疫苗的免疫原性研究硕士研究生：贺锋导师：孟继鸿教授东南大学病原生物学和免疫学系【中文摘要】病毒性肝炎(viralheptitis)是由多种肝炎病毒引起的常见传染病，我国是病毒性肝炎的高发区，在法定报告传染病中．病毒性肝炎的发病率占首位。甲型肝炎(hepatitisA，HA)是由甲型肝炎病毒(HAⅥ引起的急性病毒性肝炎，通过粪一口途径传播。乙型肝炎(hepatitisB，rm)是由乙型肝炎病毒(HBⅥ感染所导致的常见传染病之一，厂“泛流行丁：世界各国，我国是liB的高发地区。戊型肝炎(hepatitisE，rm)是一种经粪一口途径传播的急性传

2、染病，在世界各地发展中国家广泛流行，严重危害人类健康。2000年，中国第一支自主知识产权的HealiveTM甲肝灭活疫苗经历四年研制取得成功。乙型肝炎疫苗已上市多年，人量临床实践证明，是预防乙型肝炎的安全有效措施。目前HEV疫苗尚未最终研制成功，用基囡工程手段表达HEV主要结构蛋自作为HEV疫苗已成为研究韵主要方向。本实验室以往应用抗原mapping技术和基T-PCR的体外中和实验发现HEV的中和抗原表位位fHEVORF2编码蛋白c端的第452—617位氨基酸之间，在此基础上，采用原核表达系统，表达含有HEV中和抗原表位的pl79，动物实验表明，该蛋自可诱导出高滴度的抗．HEV中

3、和抗体，具有良好的免疫原性。联合疫苗是含有两种或两种以上抗原，能够预防两种或两种以上疾病的疫苗制品。由于各型肝炎病毒之问没有交叉免疫，同一个体可以感染两种或两种以上肝炎病毒。多重肝炎病毒感染较单一病毒感染的病情重，临床愈后较差。因此，研发病毒性肝炎联合疫苗对有效控制病毒性肝炎有重要意义。董晨在研究甲肝一戊肝联合疫苗时发现联合疫苗诱导小鼠产生的戊肝抗体滴度高于同剂量单价戊肝疫苗，联合疫苗诱导小鼠产生的甲肝抗体滴度不低丁同剂量的单价甲肝疫苗，甲肝一戊肝联合疫苗中，甲肝抗原成分可能起一个类似佐剂的作用，能增强戊肝抗原成分的免疫原性；张敏在研究乙肝一戊肝联合疫苗中发现当联合疫苗中乙肝抗原

4、承l戊肝抗原浓度合适时，联合疫苗诱导小鼠产生的抗一HBslgG和抗一HEVlgG不低于同剂量单价乙肝和单价戊肝疫苗。鉴丁二联合疫苗的诸多优点以及我国HA、liB、HE高度流行，重叠感染率不断增加的现状，开展了实验性甲型肝炎一乙型肝炎一戊型肝炎联合疫苗(甲肝．乙肝一戊肝联合疫苗)的研究，分析三种抗原成分的相互作用以及最佳的剂量配比。本研究主要分为以下两个部分：一实验性甲型肝炎灭活疫苗的制各及其免疫原性的研究用HLF、MRC5、Vero、FRhK-4细胞分别培养HAV(HMl75株)，不同时问点收获HAV，对收获后的病毒进行感染性滴度和培养周期比较。FRhK-4转瓶培养HAV，经密度

5、梯度离心、灭活、定量，制备实验性甲肝灭活疫苗。4i同剂最的实验性甲肝灭活疫苗和不同剂量的市售疫苗HealiveⅢ免疫小鼠。比较小鼠抗．HAV抗体出现的阳性率和抗体水平，分析实验性甲肝灭活疫苗的免疫原性。结果显示，HAV接种到FRhK-4细胞培养，两天后出现CPE，至第6天时CPE达到卅。其它3种细胞以及阴性对照瓶均没有出现CPE。HLF、MRC5、Vero培养的HAV分别在第36d、第27d、第21d时病毒产量达到高峰，其病毒感染滴度分别为5，00logCCID50／0．Iml、7．67】ogCCID50／0。lml、7．00IagCCIDsd0。lml，FRhK--4细胞培养的

6、HAV第3d感染性滴度为5．33】ogCcID√0．1ml，在第6d达到7．33109CCID5do．1ml。由SDS-PAGE电泳图可知：HAV衣壳蛋自由分子量大约为33KD、29KD、23KD的VPl、VP2、VP3组成。实验性甲肝灭活疫苗512ELISAUnit(Etogt与市售Heali诂oM20tJnit(O)flt免疫小鼠后，平均抗体水平在第4、6、8岗差别东南大学硕士学位论文均无统计学意义(P>O．05)，提示实验性甲肝灭活疫苗具有良好的免疫原性，能使小鼠产生良好的免疫应答，为甲肝．乙肝．戊肝联合疫苗的制嵛提供了良好的基础。二交叉剂量配比的实验性甲型肝炎．乙型肝炎．

7、戊型肝炎三联疫苗的免疫原性研究采用8种不同剂量配比的实验性甲肝．乙肝一戊肝联合疫苗A512+132．5+E5、A512+B2．5+E2．5、A512+B1．25+E5、A5I2+B1．25+E2．5、A256+B2．5+E5、A256+B2．5+E2．5、A256+B1．25+E5、A256+B1．25+E2．5分别免疫8组小鼠，单价甲肝灭活疫苗512EU、256EU和单价乙肝疫苗2．5119、1．25lag以及实验性单价戊肝疫苗59．g、2．5pg免疫作为对照，采用间接ELIS