药用石斛鉴定方法的系统研究

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1、北京中医药大学博士学位论文药用石斛鉴定方法的系统研究姓名：白音申请学位级别：博士专业：中药学指导教师：阎玉凝20070501独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得北京中医药大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。签名：鱼盔日期：t!12盏￡g!：!关于论文使用授权的说明

2、本人完全了解北京中医药大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全部或部分内容，也可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。(保密的论文在解密后应遵守此规定)中文摘要摘要石斛为兰科石斛属(Dendrobium)金钗石斛、铁皮石斛或马鞭石斛及其近似种的新鲜或干燥茎，具益胃生津和滋阴清热的功能。目前，我国药用石斛约有50余种，然而市场上把兰科石仙桃属Pholidota、石豆兰属Bulbophyllum和金石斛属Flickingeria的数十

3、种植物也作为药用石斛混入商品流通和临床应用，对药用石斛的临床疗效和用药安全产生了很多不良影响。笔者认为药用石斛鉴定方法的不够完善是导致上述混乱问题的主要原因，为此本文以42种药用石斛及其混淆品为研究材料，对药用石斛的性状鉴定、显微鉴定、红外光谱(IR)鉴定、高效液相色谱(HPLC)鉴定和DNA分子标记鉴定方法进行系统研究，建立其综合鉴定方法，为药用石斛及其混淆品的鉴别提供有效手段和应用平台。其主要研究结果如下：(1)性状鉴定结果表明，在16个性状特征中较有专属性的性状特征有7个，分别是茎形状、茎分枝、

4、干品质地、叶和叶鞘被黑毛、叶鞘套叠、叶片形状和叶鞘条纹；该鉴定方法能够鉴别金钗石斛D．nobile、流苏石斛D．fimbiatum和苏瓣石斛D．harveyanum等21种药用石斛及其混淆品。(2)显微鉴定结果表明，在22个显微特征中，表皮细胞大小及细胞壁增厚、皮下层细胞大小和细胞壁厚度、草酸钙方晶、草酸钙针晶以及簇状硅晶等17个显微特征的鉴别意义比较突出；该鉴定方法能够鉴别流苏石斛、金钗石斛和黑毛石斛D．williamsonii等16种药用石斛及其混淆品。本文补充和更正了金钗石斛和流苏石斛(马鞭石斛

5、)茎显微构造特征，并对未报道的8种药用石斛及其混淆品(小黄花石斛D．]enkinsii、长苏石斛D．brymerianum、叉唇石斛D．stuposum、肿节石斛D．pendulum、滇桂石斛D．guangxiense、翅梗石斛D．trigonopus、栽培石斛D．sp．cv．和密花石豆兰Bulbophyllumodoratissimum)的茎横切面显微构造进行描述。(3)IR鉴定结果表明，42种药用石斛及其混淆品具有丰富的瓜指纹特征，其取指纹峰共493个，平均每种有9～15个指纹峰，其氯仿提取物的总

6、瓜指纹峰为708个，平均每种有10～28之间；IR鉴定方法能够鉴别32种药用石斛及其混淆品。另外，瓜技术还可以用于药用石斛药效组分的红外指纹特征的表征。(4)在42种药用石斛及其混淆品中，每种共选用7～15个HPLC色谱峰，用于其HPLC鉴别。结果表明，该鉴定法能够鉴别40种药用石斛及其混淆品，其中包括药典(2005版)收载的3种药用石斛(金钗石斛、流苏石斛和铁皮石斛)。(5)利用筛选出来的5种随机引物对41种药用石斛及其混淆品进行RAPD分析，结果显示，共扩增出222个多态性位点，平均每种药用石斛及

7、其混淆品的多态性位点为12～26个之间。分析结果表明，RAPD分子标记鉴定方法能够鉴别39种药用石斛及其混淆品。(6)利用筛选出来的8种EcoRI和MseI选择性引物组合对41种药用石斛及其混淆品进行AFLP分析，结果显示，8种选择性引物共扩增出1648个位点，其中多态性位点有1643个，特异性条带有107个。分析结果表明，AFLP分子标记鉴定方法2药用石斛鉴定方法的系统研究能够鉴别39种药用石斛及其混淆品。对一份未知样品(DSP．)的AFLP鉴别结果表明，该鉴定方法适用于那些性状显微鉴定方法难以鉴别

8、的药用石斛的DNA分子鉴定。说明上述5种鉴定方法都不能完全鉴别42种药用石斛及其混淆品，为此本文在5种鉴定方法进行综合评价的基础上，建立了药用石斛综合鉴定方法，为药用石斛及其混淆品的鉴定提供了较为可行的技术和方法。(7)利用性状、显微、IR、HPLC和DNA分子标记鉴别数据，借助Access数据库软件，初步建立了药用石斛检索数据库。该数据库的主要特点是检索速度快，操作简便，并可以利用ASP应用程序打开和远程网络访问，为药用石斛及其混淆品的鉴别提供了良好的