地衣芽孢杆菌α淀粉酶定向进化的研究

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3、究兰州大学硕士学位论文地衣芽孢杆菌Q一淀粉酶定向进化研究中文摘要目的：本文主要对地衣芽孢杆菌CICCl0181耐高温a一淀粉酶基因进行克隆、表达、及定向进化的研究。方法：查阅Genbank上己提交的地衣芽孢杆菌a一淀粉酶基因编码序列，设计引物扩增出n一淀粉酶基因产物，大小为3000bp；利用PCR技术截取上游760bp进行产物测序，结果表明与其它芽孢杆菌属来源的a一淀粉酶基因具有很高的同源性，同源性达到99％；利用巢式PCR扩增出1580bp大小的a一淀粉酶基因产物，回收目的片段，克隆至大肠杆菌；经过蛋

4、白诱导表达，破壁进行酶活测定；用SDS-PABE测定淀粉酶融合蛋白分子量；利用易错PCR技术将1580bp片段分为760bp和820bp两个片段进行分子突变，用重叠延伸技术连接成完整的d一淀粉酶突变基因；克隆至大肠杆菌，用PCR鉴定及锥虫蓝培养基筛选阳性克隆；通过蛋白诱导表达，进行酶活性及蛋白质分子量测定；测序确定突变位点。结果：本实验利用PCR技术从地衣芽孢杆菌CICCl0181中扩增出q一淀粉酶基因，分子量大小为3000bp；扩增上游760bp进行PCR产物测序，结果表明与其它芽孢杆菌属来源的n～淀

5、粉酶基因具有很高的同源性，同源性达到99％；利用巢式PCR技术成功的扩增出n一淀粉酶基因，大小为1580bp；连接至pGEM—T载体，转化大肠杆菌DH5n，并筛选出6个阳性克隆；经IPTG诱导、表达淀粉酶融合蛋白，SDS—PAGE电泳显示分子量大小为60KD；经超声波破壁后测定胞内淀粉酶活性，结果显示：活力达到101U；取40号阳性克隆质粒作为模板，利用易错PCR技术对目的基因进行760bp和820bp两片段分子突变，最后重叠延伸得到大小为1580bp的淀粉酶突变基因：连接至pGEM—T载体，转化大肠杆

6、菌，用锥虫蓝培养基及PCR鉴定，筛选出2个4地衣芽孢杆菌淀粉酶定向进化研究兰州大学硕士学位论文阳性克隆；经IPTG诱导，表达得到Q一淀粉酶融合蛋白，分子量大小为60KD，测得胞内淀粉酶活性达到了156U；测序鉴定突变点三处：C163G，T417A，A574T，相应氨基酸变化为，丙氨酸一甘氨酸；亮氨酸一异亮氨酸；苏氨酸一丝氨酸；结论：利用定向进化技术对n一淀粉酶基因进行了分子改性，成功的获得了较高活性的淀粉酶菌株，初步建立了体外酶分子定向进化技术平台。关键词：地衣芽孢杆菌，淀粉酶，克隆，表达，大肠杆菌，易

7、错PCR，重叠延伸突变地衣芽孢杆菌淀粉酶定向进化研究兰州大学硕士学位论文Directedevolutionofgeneencodingalpha—amylasefrombacilluslicheniformisAbstractObjective：toacquirehigheractivitystrainofalpha—amylaseMethods：Inthisstudy,thegeneencodingahyperthermostablealpha—amylasefromabacilluslichenif

8、ormisCICCl0181，about1580bp，wasclonedinpGEM—Tvectorcontaininglacpromoter,andexpressedinEscherichiacolicellsAndfinallyweusederror-pronePCRtorandomlyintroducemutationstothegenecodingfortheBLA．Becauseerror-pronePCRisapplicable